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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9226 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Zusammenbruch der Integrität der Blut-Netzhaut-Schranke liegt pathologischen Veränderungen bei zahlreichen Augenerkrankungen zugrunde, darunter der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (nAMD) und dem diabetischen Makulaödem (DME). Während Therapien gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) die Behandlung von Krankheiten revolutioniert haben, sind immer noch neuartige Therapien erforderlich, um den ungedeckten Bedürfnissen der Patienten gerecht zu werden. Um die Entwicklung neuer Behandlungen zu unterstützen, sind robuste Methoden erforderlich, um Veränderungen der Gefäßpermeabilität im Augengewebe in Tiermodellen zu messen. Wir stellen hier eine Methode zur Erkennung der Gefäßpermeabilität mithilfe der Fluorophotometrie vor, die Echtzeitmessungen der Fluoreszenzfarbstoffansammlung in verschiedenen Kompartimenten des Mausauges ermöglicht. Wir haben diese Methode in mehreren Mausmodellen mit unterschiedlich erhöhter Gefäßleckage angewendet, darunter Modelle für Uveitis, diabetische Retinopathie und choroidale Neovaskularisation (CNV). Darüber hinaus beobachteten wir im JR5558-Mausmodell von CNV mit Anti-VEGF-Nachbehandlung eine longitudinale Verringerung der Permeabilität in denselben Tieraugen. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Fluorophotometrie eine nützliche Methode zur Messung der Gefäßpermeabilität im Mausauge ist und über mehrere Zeitpunkte hinweg eingesetzt werden kann, ohne dass das Tier geopfert werden muss. Diese Methode hat das Potenzial, sowohl in der Grundlagenforschung zur Untersuchung des Krankheitsverlaufs und der zugrunde liegenden Faktoren als auch für die Arzneimittelforschung und die Entwicklung neuartiger Therapeutika eingesetzt zu werden.

Der Verlust der Integrität der Blutbarriere, der zu Ödemen und nachfolgender Gewebeschädigung führt, wurde als Mitverursacher einer Vielzahl von Krankheiten beschrieben, darunter Sepsis1, Krebs2 und Schlaganfall3. Im Auge sind Gefäßinstabilität und die Ansammlung von Flüssigkeit in der Netzhaut und den umgebenden Geweben ein zentrales Merkmal einiger der häufigsten Erkrankungen, die das Sehvermögen bedrohen, wie etwa der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (nAMD) und dem diabetischen Makulaödem (DME). die unbehandelt zu einem schnellen Sehverlust führen kann4,5,6,7. Darüber hinaus wurden auch Augenerkrankungen wie Glaukom8 und Uveitis9 mit einer erhöhten Gefäßpermeabilität in Verbindung gebracht, obwohl möglicherweise weitere Untersuchungen erforderlich sind, um diesen Zusammenhang mit der Krankheitsursache zu klären.

Intravitreal injizierte Anti-VEGF-Inhibitoren wie Ranibizumab und Aflibercept sind zu einem Behandlungsstandard für die Behandlung von nAMD und DME10,11 geworden und haben die Sehergebnisse der Patienten revolutioniert, obwohl diese Krankheiten weiterhin die Hauptursache für Sehbehinderungen sind12, da nicht alle Patienten darauf ansprechen Bei einigen Patienten kann es trotz der Behandlung weiterhin zu einem Austritt von Netzhaut- oder subretinaler Flüssigkeit oder zu einer Fibrose und Atrophie kommen. Um einem dieser ungedeckten Bedürfnisse gerecht zu werden, ist kürzlich die nächste Generation von Therapeutika auf den Markt gekommen, die darauf abzielen, die Gefäßstabilität im Auge wiederherzustellen, wie beispielsweise Faricimab (VABYSMO; Genentech/F. Hoffmann-La Roche Ltd.), ein vaskuläres Endothelwachstum Faktor (VEGF)–Angiopoietin (Ang)-2 bispezifischer Antikörper13,14,15.

Die Entwicklung neuartiger Behandlungen, die eine pathologische Augengefäßleckage verhindern können, geht weiter, während sich unser Verständnis dieser Krankheiten weiterentwickelt. Um die Entwicklung dieser neuen Therapien zu unterstützen, sind präklinische Modelle und entsprechende Methoden erforderlich, die es ermöglichen, Veränderungen der Gefäßpermeabilität über die Zeit zu überwachen. Zu den aktuellen Permeabilitätsmethoden gehören Evans Blue16,17, Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran18 und Mikrosphären19-Perfusionstechniken sowie bildgebende Techniken wie Fluorescein-Angiographie20,21 und exogene kontrastmittelverstärkte Leckage-Optik-Kohärenz-Tomographie (OCT)22. Obwohl viele dieser Techniken gut etabliert sind, können sie auch einige Herausforderungen und Nachteile mit sich bringen, die an anderer Stelle ausführlicher erörtert werden20. Die hier beschriebene Methode kann auch in Verbindung mit bestehenden Techniken verwendet werden.

Die Fluorophotometrie ist ein vielseitiges Werkzeug, das seit langem sowohl in der klinischen als auch in der nichtklinischen Augenforschung eingesetzt wird23,24. Fluorophotometer-Instrumente wurden entwickelt, um die Konzentration von Fluorophoren im Augengewebe zu messen25 und können daher zur Bestimmung der Diffusion und Eliminierung des Referenzfarbstoffs verwendet werden, um einen Hinweis auf den physiologischen Status des Augengefäßsystems zu geben. Fluorophotometrie-Instrumente waren für Augenanwendungen wie den Wasserfluss, die Pharmakokinetik von Arzneimitteln, die Tränenfilmproduktion und Gefäßleckagen bei Menschen26, Ratten27,28 und anderen Arten29,30 verfügbar, bei Mäusen war dies jedoch bis vor relativ kurzer Zeit31 aufgrund von Einschränkungen nicht möglich von der Größe des Auges. In diesem Artikel untersuchen wir den Einsatz einer neuartigen zugänglichen Technologie zur Messung der Permeabilität in der Netzhaut, dem Glaskörper und der Vorderkammer. Wir versuchen, die Technologie in Tiermodellen für Augenerkrankungen zu validieren und ein Beispiel dafür zu liefern, wie sie zur Messung der Glaskörperpermeabilität nach einer Anti-VEGF-Behandlung eingesetzt werden könnte, um ihr Potenzial für die Entwicklung von Therapeutika zu demonstrieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Fluorophotometrie zur Überwachung und Quantifizierung von Veränderungen der Gefäßleckage im Mausauge eingesetzt werden kann, was auch neben anderen bestehenden Methoden eingesetzt werden könnte.

Der erste Schritt zur Validierung der Verwendung des Maus-Fluorophotometers bestand darin, die axialen Abstände des Scans entsprechend der Netzhaut, dem Glaskörper und der Hornhaut/Vorderkammer des Mausauges zuzuordnen. Um den Glaskörper zu erkennen, injizierten wir zunächst 20 ng Fluorescein direkt in den zentralen Glaskörperraum, gefolgt von sofortigen Messungen mit dem Fluorophotometer durch den zentralen Glaskörper. Zwischen 69 und 77 axialen Stufen wurde ein scharfer Peak beobachtet (Abb. 1a). Anschließend verabreichten wir demselben Mäuseauge topisch 20 ng Fluorescein, um die Position der Hornhaut/Vorderkammer anzuzeigen. Für die Hornhaut/Vorderkammer wurde zusätzlich zum Glaskörperpeak ein Peak zwischen 111 und 116 Axialstufen identifiziert (Abb. 1b). Bei einer zweiten Maus führte die intravitreale (IVT) Injektion von 10 ng Fluorescein (Abb. 1c) zu einem Glaskörperpeak von etwa der halben Größe der 20-ng-Dosis (Abb. 1b), jedoch im gleichen axialen Abstand. Dies zeigte die Reproduzierbarkeit des axialen Abstands unabhängig von der Fluorescein-Dosis und eine dosisabhängige Peakgröße der IVT-Injektion. Allerdings konnten wir Hornhaut- und Vorderkammermessungen aufgrund von räumlichen Auflösungsbeschränkungen nicht trennen.

Unterscheidung der verschiedenen Kompartimente des Auges anhand von Scans mit dem Fluorophotometer der Maus. Folgende Fluorophotometer-Scans wurden an Augen von C57Bl/6J-Mäusen durchgeführt; (a) intravitreale Injektion von 20 ng Fluorescein, (b) intravitreale Injektion von 20 ng Fluorescein, gefolgt von 20 ng topisch aufgetragenem Fluorescein, (c) intravitreale Injektion von 10 ng Fluorescein und (d) intravitreale Injektion von 125 ng von 70 kDa FITC-Dextran und intravenöse Injektion von 2,5 mg 70 kDa FITC-Dextran (Scans wurden an getrennten Mäusen durchgeführt und auf derselben Parzelle kombiniert). Intravitreale Injektionen wurden in den zentralen Glaskörper durchgeführt. Beschriftungen auf jeder Abbildung zeigen die Lage des Glaskörpers (Mitte), der Vorderkammer und der Netzhaut für jedes Mausauge. AC = Vorderkammer; IVT = intravitreal.

Nach der Identifizierung des Glaskörpers und der Hornhaut/Vorderkammer versuchten wir dann, Glaskörper- und Netzhautkompartimente zu unterscheiden. Mit 70 kDa FITC-Dextran, dessen große Größe im Vergleich zu Fluorescein (Molekulargewicht = 376 Da) verhindert, dass es die Blut-Netzhaut-Schranke durchdringt und von der Netzhaut in den Glaskörper diffundiert, injizierten wir einer Maus intravenös (IV) 2,5 mg FITC- Dextran und verglich die Peaks mit einer anderen Maus, der 125 ng FITC-Dextran IVT verabreicht wurde. Bei der intravenös infundierten Maus wurde ein Peak bei einem Achsabstand von 51–55° festgestellt, was der FITC-Dextran-Akkumulation in der Netzhaut entspricht, wohingegen beim IVT-verabreichten Mausauge der Glaskörperpeak bei einem Achsabstand von 69–74° festgestellt wurde. Die Überlagerung beider Spuren zeigt, dass eine Trennung der Netzhaut- und Glaskörperkompartimente möglich ist (Abb. 1d). Die in Abb. 1 identifizierten Pfadlängen für Netzhaut, Glaskörper und Hornhaut/Vorderkammer dienten als Referenz für zukünftige Augenmessungen.

Nach der Identifizierung der verschiedenen Augenkompartimente der Maus mittels Fluorophotometrie bestand unser nächstes Ziel darin, die Empfindlichkeit des Fluorophotometer-Instruments zu bestimmen, um Änderungen der Fluorescein-Dosis im Auge zu erkennen. Wir haben uns für die Verwendung von systemisch verabreichtem Fluorescein entschieden, da dies in mehreren früheren Studien31,32,33 das Fluorophor der Wahl war, mit dem wir dann vergleichen konnten. Wir entschieden uns zunächst dafür, zwei systemische Wege für die Fluorescein-Injektion zu testen: intravenös und subkutan (SC). Die intravenöse Dosierung hat den Vorteil, dass sie eine direkte Verabreichung des Farbstoffs in den Kreislauf ermöglicht und somit keine zusätzlichen Adsorptionsvariablen einführt. In unseren Händen führt die genaue Injektion kleiner Volumina jedoch zu einer höheren Variabilität, und möglicherweise sind mehr Mäuse erforderlich, um Datensätze zu generieren (ergänzende Abbildung 1). Im Gegensatz dazu führte die SC-Dosierung (Abb. 2) zu starken Veränderungen der Fluoreszenzintensität mit geringer Variabilität der Augenmessungen zwischen Tieren.

Dosis-Wirkungs- und Zeitverläufe nach subkutaner Verabreichung von Fluorescein an weibliche C57Bl/6J-Mäuse. (a) Repräsentative Scans und (b) Quantifizierung von Fluorescein in der Netzhaut, im Glaskörper und in der Vorderkammer, gemittelt nach 30 Minuten, von Mäusen, denen 0,25, 0,50 und 1,0 mg Fluorescein subkutan injiziert wurden. Zeitverläufe, die Fluoreszenzniveaus in (c) der Netzhaut und dem Glaskörper und (d) der Vorderkammer von C57Bl/6J-Mäusen zeigen, 5–60 Minuten nach subkutaner Injektion von 1 mg Fluorescein. N = 5–6 Mäuse für Dosis-Wirkungen in (a und b) und N = 3 Mäuse für Zeitverläufe (c und d). R = Netzhaut; V = Glaskörper; AC = Vorderkammer; SC = subkutan.

In einem ersten Experiment verwendeten wir steigende Dosen von 0,25, 0,5 und 1,0 mg Fluorescein, das SC injiziert wurde, und führten nach 30 Minuten Scans des Auges durch. Wir beobachteten einen dosisabhängigen Anstieg von Fluorescein in jedem Kompartiment, wie im durchschnittlichen Scanprofil (Abb. 2a) gezeigt, der durch Messungen der Fläche unter der Kurve (AUC) der Fluoreszenzsignale in der Netzhaut, im Glaskörper und in der Vorderkammer quantifiziert werden konnte (Abb. 2b). Aus diesem Experiment haben wir die 1-mg-Dosis für die in Abb. 2c, d gezeigten Zeitverlaufsexperimente ausgewählt, da diese Dosis für den Nachweis der Fluoreszenz in den verschiedenen Augenkompartimenten der Maus optimal war.

Als nächstes überwachten wir alle 5 Minuten die Ansammlung von Fluorescein in den verschiedenen Augenkompartimenten, bis zu 60 Minuten nach der Injektion. Im Glaskörper (Abb. 2c) und in der Vorderkammer (Abb. 2d) wurde eine lineare Erhöhung des Fluoresceins festgestellt. In der Netzhaut waren die Fluoresceinspiegel etwa 20 Minuten nach der SC-Injektion gesättigt (Abb. 2c). Bei der IV-Dosierung (ergänzende Abbildung 1) wurden ähnliche Trends im Vergleich zur SC-Dosierung in der Vorderkammer und im Glaskörper beobachtet, allerdings erreichten die Fluoresceinspiegel in der Netzhaut 5 Minuten nach der Verabreichung ihren Höhepunkt und verringerten sich im Verlauf des Experiments, vermutlich aufgrund höherer systemischer Werte Spielraum.

Als Ergebnis dieser Experimente entschieden wir uns, für alle nachfolgenden Experimente mit einer Dosis von 50 mg/kg Fluorescein fortzufahren, wie in den Abbildungen gezeigt. 3, 4 und 5. Die Dosis von 50 mg/kg entspricht ungefähr einer Gesamtdosis von 1 mg Fluorescein, die für frühere Zeitverlaufsexperimente für eine Maus mit etwa 20 g verwendet wurde. Die Anpassung an das Körpergewicht sorgt für gleichmäßigere Fluorescein-Plasmaspiegel. Darüber hinaus wurden für die verbleibenden Experimente die Fluoresceinspiegel in den verschiedenen Augenkompartimenten auf Plasmawerte normalisiert und als solche ausgedrückt.

Anwendung des Maus-Fluorophotometers im Endotoxin-induzierten Uveitis-Modell. LPS (1 ng) oder PBS wurde intravitreal in die Augen von C57Bl/6J-Mäusen injiziert, und 24 Stunden später wurden Fluorophotometrie, OCT und Fluorescein-Angiographie an Mäusen durchgeführt, denen 50 mg/kg Fluorescein subkutan injiziert wurden. (a) Repräsentative Fluorescein-Angiographie (obere Felder) und OCT-Bilder (untere Felder) von mit PBS (links) und LPS (rechts) behandelten Mäuseaugen 50 Minuten nach der Verabreichung von Fluorescein. Der Pfeil im OCT-Bild des mit LPS injizierten Auges zeigt das Vorhandensein infiltrierender Immunzellen im Glaskörper. (b–d) Zeitverläufe zur Quantifizierung der Fluoresceinspiegel in (b) der Netzhaut, (c) im Glaskörper und (d) der Vorderkammer mittels Fluorophotometrie zeigten keine signifikanten Unterschiede in den Fluoresceinspiegeln in der Netzhaut und der Vorderkammer zwischen PBS und LPS Behandlung. Allerdings wurde im Glaskörper nach der LPS-Behandlung ein signifikanter Anstieg zu späteren Zeitpunkten von 45 auf 60 Minuten beobachtet. Die in (b–d) gezeigten Daten sind auf die Plasmaspiegel von Fluorescein korrigiert. (e) Die Plasmaspiegel von Fluorescein unterschieden sich nicht signifikant zwischen den PBS- und LPS-Behandlungsgruppen. Maßstabsbalken = 500 µm. N = 5–8 Augen pro Zeitpunkt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, unter Verwendung der Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichen. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben. PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; LPS = Lipopolysaccharid.

Quantifizierung der Permeabilität im Streptozotocin (STZ)-Diabetiker-Mausmodell mittels Fluorophotometrie. In diesem Experiment wurden Mäuse verwendet, bei denen 10 Wochen zuvor mit STZ Diabetes induziert worden war, und sie wurden mit altersentsprechenden, nicht diabetischen Kontrolltieren verglichen. (a) Der Blutzuckerspiegel war bei Mäusen mit STZ-Diabetes 10 Wochen nach der Diabetes-Induktion signifikant erhöht, wohingegen (b) sich das Körpergewicht nicht signifikant von dem der nicht-diabetischen Kontrollmäuse unterschied. Im Vergleich dazu waren die Fluoresceinspiegel in (c) der Netzhaut, (d) dem Glaskörper und (e) der Vorderkammer bei STZ-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten von 40 bis 60 Minuten nach der Injektion von 50 mg/kg subkutanem Fluorescein signifikant erhöht mit nicht-diabetischen Kontrollen. Die in (c–e) gezeigten Daten sind auf die Plasmaspiegel von Fluorescein korrigiert. (f) Die Plasmaspiegel von Fluorescein unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Behandlungsgruppen von STZ-diabetischen und nicht-diabetischen Kontrollmäusen. N = 6–16 Augen pro Zeitpunkt. Blutzucker und Körpergewicht werden statistisch durch Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen bestimmt, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Die Leckage des Augenraums wurde statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen bewertet, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben.

Quantifizierung der Permeabilität im spontanen CNV-Mausmodell JR5558 und Reaktion auf eine Anti-VEGF-Behandlung, gemessen mittels Fluorophotometrie. (a–c) Männliche und weibliche JR5558-Mäuse sowie altersentsprechende Kontrollmäuse C57Bl/6J wurden subkutan mit 50 mg/kg Fluorescein injiziert, und es wurden Zeitverläufe der Verhältnisse der Fluoresceinspiegel korrigiert zum Plasma in getrennten Augenkompartimenten gemessen. JR5558-Mäuse hatten im Vergleich zu C57Bl/6J-Mäusen signifikant erhöhte Fluoresceinspiegel in (a) der Netzhaut und (b) dem Glaskörper. Die Fluoresceinspiegel in (c) der Vorderkammer und (d) im Plasma unterschieden sich nicht signifikant. (e–g) JR5558-Mäusen wurden zu Studienbeginn (Tag 0) und am Tag 3 intraperitoneal Anti-VEGF- oder IgG-Kontrollantikörper verabreicht, und das Austreten von Fluorescein wurde zu Studienbeginn und am 7. Tag mithilfe der Fluorophotometrie quantifiziert gemessen 45 Minuten nach subkutaner Fluorescein-Gabe. (e) Die Anti-VEGF-Behandlung reduzierte die Menge an Fluorescein im Glaskörper signifikant auf etwa 77 % des Ausgangswerts (f), wohingegen die IgG-Kontrolle keinen signifikanten Effekt hatte. (g) Repräsentative Fluoreszenzangiographiebilder der Augen von JR5558-Mäusen zu Studienbeginn (linke Felder für jede Behandlungsgruppe) und nach der Behandlung (rechte Felder für jede Behandlungsgruppe) nach IgG- oder Anti-VEGF-Behandlung. N = 3–6 Augen für Zeitverläufe, N = 12 Augen pro Gruppe für IgG- und Anti-VEGF-Behandlungen. Maßstabsbalken = 500 µm. Die Leckage des Augenraums wurde statistisch durch eine Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen bewertet, gefolgt von Bonferronis Mehrfachvergleichstest. Die zu Beginn und nach der Behandlung korrigierten Fluoresceinkonzentrationen im Glaskörper wurden durch eine einfache ANOVA und anschließend durch den Mehrfachvergleichstest von Newman Keul bewertet. Prozentuale Veränderung gegenüber dem Ausgangswert, statistisch ermittelt durch ungepaarten T-Test. *P < 0,05, **P < 0,01. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben.

Nach Auswahl der Dosis und des Verabreichungswegs von Fluorescein begannen wir mit der Prüfung der Eignung des Maus-Fluorophotometers zur Erkennung von Veränderungen der Gefäßpermeabilität in Krankheitsmodellen. Als erstes untersuchten wir die Endotoxin-induzierte Uveitis (EIU), ein Modell der Uveitis anterior. Das Endotoxin LPS wurde IVT injiziert, um eine Entzündung und einen Abbau der Blut-Netzhaut-Schranke auszulösen. Anschließend wurden 24 Stunden später Fluoreszenzangiographie, OCT und Fluorophotometrie durchgeführt (Abb. 3). Die Behandlung von Augen mit LPS führte zu einer Gefäßleckage, wie mittels Fluoreszein-Fundusangiographie beobachtet, mit einem damit einhergehenden Anstieg des Einstroms entzündlicher Zellen, der durch OCT-Bildgebung beobachtet werden konnte (Abb. 3a). Parallel dazu führten wir eine Fluorophotometrie durch, und bei mit LPS behandelten Tieren schien es im Vergleich zu Mäusen, denen PBS injiziert wurde, zwischen 15 und 25 Minuten zu einer langsameren Fluoresceinaufnahme in der Netzhaut zu kommen (Abb. 3b), dies erreichte jedoch keine Signifikanz. Darüber hinaus gab es nach 30 Minuten und später keine signifikanten Unterschiede in den Fluoresceinspiegeln im Vergleich zur PBS-Kontrollgruppe, wie dies auch für die Vorderkammer der Fall war (Abb. 3d). Im Gegensatz dazu beobachteten wir im Glaskörperkompartiment in mit LPS behandelten Augen höhere Fluoresceinwerte, die nach 45 Minuten eine Signifikanz erreichten und bis 60 Minuten anhielten (P < 0,05; Abb. 3c). Die Plasmaspiegel nach 60 Minuten unterschieden sich nicht signifikant zwischen LPS- und PBS-Gruppen (Abb. 3e), daher waren Unterschiede in den Fluoresceinspiegeln im Glaskörper wahrscheinlich unabhängig von Änderungen der systemischen Exposition.

Nach der Validierung des Maus-Fluorophotometers mit EIU wechselten wir als nächstes zum STZ-induzierten Maus-Diabetes-Modell, um zu sehen, ob Veränderungen der Gefäßleckage im Zusammenhang mit chronischer Hyperglykämie beobachtet werden konnten. Nach der Auslösung von Diabetes beobachteten wir erstmals nach 2 Wochen bei den Mäusen eine Hyperglykämie (Daten nicht gezeigt), die bis mindestens 10 Wochen nach der STZ-Injektion erhöht blieb (Abb. 4a). Die Tiere nahmen sowohl bei den nicht-diabetischen Kontrollmäusen als auch bei den STZ-diabetischen Mäusen weiterhin an Gewicht zu, jedoch langsamer in der STZ-Gruppe, was keine Signifikanz erreichte (Abb. 4b).

Da die Fluorophotometrie in den Anfangsphasen der Messungen nach der Fluorescein-Injektion niedrige Nachweiswerte ergab, waren die Nachweiswerte weniger konsistent und zuverlässig. Daher haben wir die frühen Zeitpunkte nach der Injektion eliminiert und nur Messungen von 40 bis 60 Minuten einbezogen. Die Fluoresceinspiegel in jedem Augenbereich unterschieden sich deutlich von denen der nicht-diabetischen Kontrollgruppen. Sowohl in der Netzhaut als auch in der Vorderkammer (Abb. 4c und e) waren die Fluoresceinspiegel bei STZ-diabetischen Mäusen im Vergleich zu nicht-diabetischen Kontrollen ab 50 Minuten erhöht. Im Glaskörper war zu allen gemessenen Zeitpunkten ein signifikanter Anstieg des Fluoresceins erkennbar (Abb. 4d). Plasmafluorescein war bei STZ-Mäusen reduziert (Abb. 4f), die Werte erreichten jedoch keine Signifikanz.

In einem abschließenden Validierungsexperiment verwendeten wir das JR5558-Mausmodell der spontanen Aderhautvaskularisation (CNV). Die JR5558-Maus wurde zuvor in präklinischen Studien zum Testen neuartiger Therapeutika verwendet34,35, daher wollten wir dieses Modell verwenden, um die Verringerung der Permeabilität in Längsrichtung in denselben Tieraugen nach der VEGF-Neutralisierung zu überwachen. Zunächst verglichen wir die Fluorescein-Akkumulation im JR5558 mit altersentsprechenden C57Bl/6J-Kontrollmäusen, um zu sehen, wie sich das Vorhandensein von CNV auf die Leckage auswirkte. Für diese Experimente verwendeten wir Mäuse im Alter von 13 Wochen, die bereits sehr ausgeprägte Läsionen aufwiesen. In der Netzhaut stieg Fluorescein zwischen 45 und 55 Minuten nach subkutaner Verabreichung von JR5558-Mäusen an (Abb. 5a), unterschied sich jedoch nach 60 Minuten nicht signifikant von C57BL/6J. Im Glaskörper wurde zu Zeitpunkten von 45 bis 60 Minuten ein signifikanter Anstieg von Fluorescein beobachtet (Abb. 5b). Für die Vorderkammer wurden keine signifikanten Veränderungen zwischen C57Bl/6J- und JR5558-Mäusen beobachtet (Abb. 5c), und die Plasmaspiegel unterschieden sich nicht zwischen den Mausstämmen (Abb. 5d).

Um die Wirkung der VEGF-Neutralisierung auf die CNV-Leckage bei den JR5558-Mäusen zu untersuchen, verabreichten wir 8 Wochen alten JR5558-Mäusen zweimal intraperitoneal IgG-Kontroll- oder Anti-VEGF-Antikörper. Die Anreicherung von Fluorescein wurde nur im Glaskörper gemessen, da die Fluoresceinwerte in der Netzhaut zu unterschiedlich waren (aufgrund des Vorhandenseins von undichten neovaskulären Läsionen, die punktförmige Bereiche mit sehr hohem Fluoresceinsignal erzeugten) und die neovaskuläre Pathologie in der Vorderkammer fehlte. Zu Studienbeginn unterschieden sich die Fluoresceinspiegel im Glaskörper in den IgG- und Anti-VEGF-Gruppen nicht signifikant. Nach der Behandlung veränderten sich die Fluoresceinspiegel im Glaskörper in der IgG-Gruppe nicht, in der Anti-VEGF-Gruppe war jedoch eine signifikante Reduzierung um 25 % gegenüber dem Ausgangswert zu verzeichnen (P < 0,05; Abb. 5e,g). Als wir die prozentuale Veränderung jedes einzelnen Tieres gegenüber dem Ausgangswert berechneten, wurden ähnliche Effekte beobachtet, mit einer Gesamtreduzierung von 19 % in der Anti-VEGF-Gruppe gegenüber einem Anstieg von 7 % in den IgG-Kontrollgruppen (Abb. 5f). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Fluorophotometer bei Mäusen verwendet werden kann, um Veränderungen der Permeabilität als Reaktion auf die Behandlung in Längsrichtung zu beurteilen.

Hier demonstrieren wir eine Methode zur Echtzeitmessung von Veränderungen der Gefäßpermeabilität in vivo im Mausauge. Die Methode wurde auf Mausmodelle mit diabetischer Retinopathie, Uveitis und Aderhautneovaskularisation angewendet, bei denen im Vergleich zu Kontrolltieren ein Anstieg der Gefäßleckage beobachtet wurde. In einem abschließenden Experiment haben wir gezeigt, dass es möglich ist, die erhöhten Fluoresceinspiegel durch eine Anti-VEGF-Behandlung abzuschwächen, und gezeigt, dass sowohl Vor- als auch Nachbehandlungsänderungen der Durchlässigkeit in denselben Tieraugen gemessen werden können.

Wie bei jeder Methode hängt der Erfolg von der optimalen Nutzung der Technologie ab. Beim Maus-Fluorophotometer müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden. Es ist wichtig, den optischen Kopf des Fluorophotometers genau auf die Mitte der Sehachse der Maus auszurichten, um ein konsistentes Scannen für reproduzierbare Daten zu ermöglichen. Da es sich bei der Maschine um ein optisches Gerät handelt, das auf fokussierter Anregung und Detektion der Lichtemission basiert, ist es wichtig, eine möglichst störungsfreie Sichtachse zu haben. Ein anfängliches Problem bestand darin, dass Mäuseaugen unter Narkose, selbst bei regelmäßiger Befeuchtung, dazu neigen, Katarakte zu entwickeln36, was die Aufzeichnung der Fluoresceinspiegel im hinteren Augengewebe unmöglich macht. Wir fanden heraus, dass die Lösung darin bestand, nach Einleitung der Anästhesie Kontaktlinsen auf das Mäuseauge aufzutragen, was die Entstehung von Katarakt verhinderte. Darüber hinaus müssen die Kontaktlinsen frei von Rückständen sein, die durch eintrocknende Flüssigkeit (z. B. PBS) auf der Linsenoberfläche zurückbleiben. Dieses Problem kann gelöst werden, indem die Linsen vor der Verwendung in hochreinem Wasser gespült werden.

Die Methode hängt auch mit der Aufrechterhaltung einer klaren Sehachse zusammen und kann empfindlich auf Schäden am Augengewebe reagieren, beispielsweise durch intravitreale Injektionen oder durch entzündungsauslösende Stoffe. Wir fanden heraus, dass wir in unseren Experimenten mit intravitrealer LPS-Verabreichung die LPS-Dosis titrieren und intravitreale Injektionen mit stumpfen Nadeln der Größe 34 durchführen mussten, um das Auftreten von Glaskörperblutungen oder Entzündungszellen in der Vorderkammer zu minimieren. Es wurden Schwankungen zwischen verschiedenen LPS-Chargen beobachtet, daher war es wichtig, nach Möglichkeit identische Chargennummern zu verwenden. Eine konsequente Augenerweiterung war ebenfalls unerlässlich; Nach der Anästhesie wurden Dilatationsmittel hinzugefügt, wobei jedem Auge das gleiche Volumen Tropicamid verabreicht wurde.

In unseren Experimenten haben wir Fluorescein als Farbstoff getestet, da es häufig in Bildgebungs- und Permeabilitätsstudien verwendet wird und ein günstiges Sicherheitsprofil für die wiederholte Verwendung bei Mäusen aufweist. Andere Farbstoffe mit unterschiedlichen Molekulargewichten eignen sich möglicherweise besser für die Erkennung leckageabhängiger Veränderungen in Fluorophotometrie-Experimenten, liegen jedoch außerhalb des Rahmens des aktuellen Manuskripts. Wir verwendeten für Fluorescein in erster Linie den subkutanen Verabreichungsweg, da er sich als am einfachsten durchzuführen erwies, zu weniger Dosierungsfehlern führte und das Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zum intravenösen Weg verringerte. Eine weitere kritische Variable war der Zeitpunkt der Fluorescein-Gabe an die Tiere. Wir fanden heraus, dass die Dosierung der Tiere nach der Narkose die Variabilität unserer Ergebnisse drastisch verringerte, möglicherweise weil Mäuse unter Narkose statisch sind und möglicherweise ähnliche Stoffwechselraten aufweisen.

Die Maus-Fluorophotometrie bietet entscheidende Vorteile gegenüber einigen bestehenden Techniken zur Messung der Permeabilität, wie z. B. Evans-Blau oder anderen perfusionsbasierten Methoden. Erstens ist es nicht notwendig, das Tier zu opfern, um den Test durchzuführen, was bedeutet, dass Tiere potenziell für mehrere Experimente verwendet werden können. Dies wird die Umsetzung der 3R-Prinzipien (Reduktion, Verfeinerung und Ersatz) in der Tierforschung unterstützen29. Zweitens ist es möglich, die Gefäßleckage im selben Tier im Längsschnitt durch wiederholte Messungen zu überwachen, wodurch Forscher die Auswirkungen vor und nach der Behandlung oder die Entwicklung der Permeabilität über die Zeit in Augenkrankheitsmodellen berechnen können. Drittens kann die Methode auch in Kombination mit etablierteren Permeabilitätsmethoden wie Evans Blue und gekoppelt mit bildgebenden Verfahren wie der Fluoreszenzangiographie eingesetzt werden. Da das Gerät außerdem für den Einsatz bei Mäusen geeignet ist, bedeutet dies, dass es möglich ist, Leckagemessungen mit einer gezielten genetischen Manipulation bei der Art zu kombinieren, um nach Faktoren zu suchen, die zum Zusammenbruch der Blut-Netzhaut-Schranke beitragen. Ein Nachteil besteht jedoch darin, dass die Ergebnisse bei Mäusen aufgrund der erheblichen Unterschiede in der Augen- und Systemanatomie und -physiologie mit Vorsicht zu genießen sind, wenn versucht wird, die absoluten Leckagewerte zwischen den Spezies direkt zu vergleichen, auch in Studien am Menschen.

Zusammenfassend würden wir empfehlen, dass das Maus-Fluorophotometer in Experimenten verwendet werden könnte, bei denen eine klare Sehachse aufrechterhalten werden kann. Behandlungen oder genetische Veränderungen, die beispielsweise zu Katarakten, Hyphemen oder Glaskörperblutungen führen, können mit Methoden wie Evans Blue oder anderen perfusionsbasierten Methoden besser behandelt werden. Wenn die Sehachse jedoch klar bleiben kann, kann die Maus-Fluorophotometrie über mehrere Zeitpunkte hinweg neben bestehenden Methoden eingesetzt werden und kann in Verbindung mit bildgebenden Methoden wie der Fluoreszenzangiographie verwendet werden, bei denen ein Augenbild aussagekräftig sein kann. Wenn der Forscher seine Daten außerdem mit perfusionsbasierten Methoden vergleichen möchte, ist er bei Bedarf immer noch in der Lage, dies zu tun.

Zusammenfassend halten wir das Maus-Fluorophotometer für ein sehr nützliches Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Arzneimittelentwicklung. Da die nächste Generation von Therapeutika für feuchte altersbedingte Makuladegeneration und diabetisches Makulaödem auf den Markt kommt, ist es klar, dass die besten Werkzeuge dazu beitragen werden, Medikamente zu identifizieren, die mit neuartigen Signalwegen interagieren und so die optimale Kombination aus Flüssigkeitskontrolle und Dauerhaftigkeit der Behandlungswirkung bieten . Das Maus-Fluorophotometer bietet möglicherweise eine zusätzliche Methode, um die besten neuartigen Behandlungen herauszufiltern.

Tabelle 1 zeigt Informationen zu Stamm, Alter, Geschlecht und Lieferant der Tiere, die in den verschiedenen Experimenten der Studie verwendet wurden.

Alle Tiere erhielten nach Belieben Futter und Wasser in einer temperaturkontrollierten Umgebung mit einem 12-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus. Tierversuche wurden vom Bundesamt für Lebensmittelsicherheit und Veterinärwesen der Schweiz (Referenzen BS-2730 und BS-2734) genehmigt und unter strikter Einhaltung der eidgenössischen Tierschutz- und Tierschutzverordnung sowie den Regeln des Vereins durchgeführt Richtlinien für die Forschung in der Augen- und Augenheilkunde und in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien.

Für intravitreale (IVT) Lipopolysaccharid (LPS)-Injektionen wurden die Tiere mit Isofluran 3 %, O2 100 % anästhesiert. Für alle anderen Experimente wurden Mäuse mit der subkutanen Kombination von Medetomidin (Dorbene®, 0,5 mg/kg, Graeub AG, Bern, Schweiz), Midazolam (5 mg/kg, Roche Pharma AG, Grenzach-Whylen, Deutschland) und Fentanyl anästhesiert ( Curamed®, 0,05 mg/kg, Actavis Switzerland AG, Regensdorf, Schweiz). Für Erholungsexperimente wurden Mäuse dann mit einer Kombination aus Buprenorphin (Bupaq®, 0,2 mg/kg, Streuli Pharma AG, Uznach, Schweiz), Atipemazol (Alzane®, 2,5 mg/kg, Graeub AG, Bern, Schweiz) und Flumazenil antagonisiert (Anexate®, 0,5 mg/kg, Roche Pharma AG, Grenzach-Whylen, Deutschland).

Vor der IVT-Anwendung wurde eine Lösung von LPS (Cat L6529; Sigma, St. Gallen, Schweiz) in steriler Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS; Life Technologies, Schweiz) aus gefrorenen Aliquots, die bei –20 °C gelagert wurden, mit einer Endkonzentration von hergestellt 1 ng/1 µl. Die Tiere wurden mit Isofluran betäubt und es wurden Tropfen Lokalanästhetikum (Novesin®; OmniVision, Schweiz) und Mydriatika (Tropicamide 0,5 % SDU Faure, Théa Pharma SA, Schaffhausen, Schweiz) aufgetragen. Die Augen wurden mit Povidon-Jod 5 % (iso-Betadine® 5 %, MEDA-Pharma GmbH & Co.KG, Bad Hombourg, Deutschland) gespült, gefolgt von sterilem PBS, dann mit einer Nanofil-Spritze und angeschlossener 34-Gauge-Nadel ( NF34BL-2) (beide World Precision Instruments International, Friedberg, Deutschland) wurde 1 µl/Auge LPS oder PBS (Kontrolle) injiziert. Abschließend wurden die Tiere zur Erholung wieder in die Stallbox gesetzt.

Nach 24 Stunden wurden die Mäuse mit subkutaner Anästhesie betäubt. Anschließend wurden Bilder der Netzhaut und des Glaskörpers mittels Fluoreszenzangiographie (FA) und Augenkohärenztomographie (OCT) aufgenommen, um das Vorhandensein infiltrierender Entzündungszellen zu bestätigen. Nach der Bildgebung wurden die Mäuse einer Fluorophotometrie unterzogen.

Die Tiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt und erhielten an fünf aufeinanderfolgenden Tagen entweder Streptozotocin (STZ; 50 mg/kg Körpergewicht, 7,5 mg/ml, zubereitet in 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5) oder intraperitoneal (IP) injiziertes PBS. STZ wurde vorbereitet und mindestens 30 Minuten vor der Verabreichung im Kühlschrank aufbewahrt. Fünf Tage nach den letzten STZ- oder PBS-Dosen wurde der Blutzucker mittels Schwanzvenenpunktion mit einem AlphaTrak-Blutzuckermessgerät (Abbott Laboratories Inc USA, Alameda, CA) und Teststreifen (Alpha Trak2, Zoetis Schweiz, Zürich Schweiz) gemessen. Die Entwicklung von Diabetes wurde als Blutzuckerspiegel über 14 mmol/L (250 mg/dl) definiert. Tiere mit einem Glukosespiegel unter 250 mg/dl erhielten keine erneute Injektion und wurden nicht in die Studie einbezogen. Das Gewicht und der Blutzuckerspiegel des Tieres wurden während der gesamten Studie überwacht und nur Mäuse mit kontinuierlich erhöhten Blutzuckerwerten wurden als Diabetiker betrachtet. Für Fluorophotometriemessungen wurden die Tiere 10 Wochen nach der STZ gemessen.

Während der gesamten Studien wurden männliche und weibliche JR5558-Mäuse33 verwendet. Für die Zeitverlaufsstudien und die Studien zur pharmakologischen Anti-VEGF-Behandlung waren die Tiere 13 bzw. 8 Wochen alt. Für Experimente zur medikamentösen Behandlung wurden die Mäuse in Woche 8, am Tag vor der Antikörperdosierung, zu Beginn einer Fluoreszenzangiographie (FA)34 und einer Fluorophotometrieuntersuchung unterzogen, um die Tiere Behandlungsgruppen mit statistisch gleicher (P > 0,05; ungepaarter t-Test) Anzahl an Läsionen zuzuordnen und Fluoresceinkonzentrationen in verschiedenen Augenkompartimenten. Anti-VEGF- (B20-4.137) oder IgG-Kontrollantikörper wurden einen Tag nach Studienbeginn ip und drei Tage später eine wiederholte Dosis verabreicht (1 ml/100 g Körpergewicht, insgesamt 2 Dosen). FA- und Fluorophotometriedaten wurden eine Woche nach der ersten Antikörperdosis erneut erfasst, um die Auswirkungen der Anti-VEGF- und IgG-Kontrolle vor und nach der Behandlung zu vergleichen. Für die Ausgangs- und Nachbehandlungsbewertung von JR5558-Mäusen wurde der 45-Minuten-Zeitpunkt für die Fluorophotometrie ausgewählt.

Fluorophotometriemessungen wurden mit einem scannenden Okular-Fluorophotometer (Fluorotron Master Research Mouse Edition; OcuMetrics, Inc., Mountain View, CA) durchgeführt. Ein detaillierteres Protokoll, das die in diesem Manuskript verwendeten Methoden beschreibt, finden Sie im Abschnitt „Ergänzende Methoden“.

Um sicherzustellen, dass die in unseren Experimenten gemessenen Fluorescein-Konzentrationen im linearen Bereich lagen, haben wir eine Fluorescein-Standardkurve erstellt. In späteren Experimenten wurden zur Berechnung der Fluoresceinwerte keine Standardkurven verwendet, da das Fluorophotometer direkte Messungen von Fluorescein in ng/ml ermöglicht. Die Standardkurve wurde in Mikroküvetten mit PBS als Verdünnungsmittel unter Verwendung des vom Hersteller gelieferten Mikroküvettenhalters durchgeführt. Unter Verwendung dieser Standardkurve wurde eine lineare Beziehung mit steigender Fluoresceinkonzentration beobachtet (R2 > 0,99; Abb. 6), was darauf hindeutet, dass die in unseren Experimenten beobachteten Veränderungen der Fluoresceinspiegel auf konzentrationsabhängige Unterschiede zurückzuführen waren.

Fluorescein-Standardkurven. Standardkurven für Fluorescein in (A) PBS und (B) Plasma. Fluorescein-Standards wurden in PBS oder Mausplasma hergestellt und dann weiter in PBS verdünnt, bevor die Fluorescein-Konzentration (ng/ml) in einer Mikroküvette gemessen wurde. Es wurde eine Regressionsanalyse durchgeführt, wobei die Statistiken in den Diagrammen in der Abbildung dargestellt sind.

Für In-vivo-Experimente wurden die Tiere mittels subkutaner Anästhesie betäubt. Nach der Anästhesie wurden die Augen mit 0,5 % Tropicamid (Tropicamide 0,5 % SDU Faure, Théa Pharma, Schaffhausen, Schweiz) erweitert, dann 5 Minuten später mit Fluoresceinlösung (Kat. 46.960; Sigma-Aldrich, St. Gallen, Schweiz) oder FITC-Dextran 70 kDa ( Katze 46.945; Sigma-Aldrich, St. Gallen, Schweiz) wurde entweder IV, IVT oder SC in den in den Ergebnisabschnitten beschriebenen Dosen verabreicht. Um möglichst konsistente Ergebnisse zu erzielen, hielten wir es für am besten, nach der Anästhesie Fluoreszein zu verabreichen.

Nach der Fluorescein-Injektion wurden 3,2-mm-Plankontaktlinsen (Cantor und Nissel, Northamptonshire, UK) auf die Augen der Maus gesetzt. Kontaktlinsen werden verwendet, um ein Austrocknen zu verhindern, das zur Entstehung von Katarakt führen kann. Anschließend wurden die Tiere auf einen temperierten (37 °C) Tisch gestellt und die Augen parallel zum optischen Gerät ausgerichtet. Augenscans wurden sowohl vom linken als auch vom rechten Auge unter Verwendung einer Anregung bei 450–490 nm und einer Emissionsdetektion bei 520–600 nm zu den in jedem Ergebnisabschnitt angegebenen Zeitpunkten aufgezeichnet. Augenscans dauerten etwa 20 Sekunden pro Scan.

In einigen Fällen wurden nach der Fluorophotometrie Blutproben (25 µl) aus der Schwanzvene zur Plasmavorbereitung entnommen (Microvette CB 300K2E; Sarstedt AG, Deutschland), um die Scans auf zirkulierendes Fluorescein zu normalisieren und mögliche Unterschiede bei der Verabreichung zu berücksichtigen. Blutproben wurden 10 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert, dann wurden 10 µl des resultierenden Plasmas in 990 µl PBS in einer vor Licht geschützten Mikroküvette (PS Micro Photometer Cuvette 2 ml; LP Italiana, Mailand, Italien) verdünnt und auf dem Gerät gescannt Fluorotron-Gerät mit dem mitgelieferten Küvettenhalter, außerdem mit 450–490 nm Anregung und 520–600 nm Emissionsdetektion.

Zur Quantifizierung der Fluorophotometriemessungen wurden Rohdaten als TXT exportiert. Dateien erstellt und dann mit Microsoft Excel geplottet. Die durchschnittliche Fläche unter der Kurve (AUC) wurde für 5 Schritte in jedem der Bereiche der Scans berechnet, die Netzhaut-, Glaskörper- und Vorderkammer-Peaks entsprechen, wie durch Augenkompartiment-Experimente bestimmt (Abb. 1). Daten, die nicht auf Plasmafluorescein normalisiert sind, werden als Fluorescein ng/ml ± SEM ausgedrückt.

Zur Plasmanormalisierung wurde das zirkulierende Fluorescein durch Mittelung der maximalen Spitzenwerte von Doppelscans berechnet. Die Fluoresceinspiegel in den Augenkompartimenten wurden dann als Verhältnis zum Plasma-Fluorescein ausgedrückt, indem die rohen AUC-Durchschnittswerte durch die Plasmawerte dividiert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM-Verhältnis von Augenkompartiment:Plasma-Fluorescein ng/ml ausgedrückt.

Rohdaten wurden aus dem Fluorophotometer in TXT-Dateien exportiert und in Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) kopiert. Die Verarbeitung und Analyse erfolgte mit der Software Excel und GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Für den statistischen Vergleich von nur zwei Gruppen wurde ein ungepaarter t-Test verwendet. Für Vergleiche von drei oder mehr Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von Newman Keuls Mehrfachvergleichstest verwendet. Für Zeitverlaufsdaten wurde die Zwei-Wege-Varianzanalyse ANOVA (Alpha 0,05) mit wiederholten Messungen und anschließenden mehreren Vergleichstests verwendet (weitere Einzelheiten finden Sie in den Legenden der Abbildungen). Ausreißer wurden vor der statistischen Analyse unter Verwendung der Chauvenet-Kriterien entfernt, wobei Ausreißer als ± 2 × Standardabweichungen vom Mittelwert definiert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM mit *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 dargestellt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren möchten Bruce Ishimoto danken, zunächst für die freundliche Leihgabe einer Prototypversion des Fluorotron Master Mouse Edition-Geräts, aber auch für seinen technischen Rat und seine Unterstützung. Dieses Manuskript ist Professor David Shima gewidmet.

Ophthalmologische Entdeckung, Pharmaforschung und frühe Entwicklung, Roche Innovation Center Basel, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz

Nadine Colé, Janina Thoele, Christoph Ullmer und Richard H. Foxton

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NC: Studiendesign, Datenanalysen und Statistiken, In-vivo-Arbeit, Überprüfung und Verfassen von Manuskripten; JT: Studiendesign, In-vivo-Arbeit, Überprüfung und Verfassen von Manuskripten; CU: Überprüfung und Verfassen von Manuskripten; RF: Studiendesign, Datenanalysen und Statistiken, In-vivo-Arbeit, Überprüfung und Verfassen von Manuskripten. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Richard H. Foxton.

NC, JT, CU und RF waren zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Experimente alle Mitarbeiter von F. Hoffmann-La Roche Ltd.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Colé, N., Thoele, J., Ullmer, C. et al. Echtzeitmessungen der Gefäßpermeabilität im Mausauge mittels Glaskörper-Fluorophotometrie. Sci Rep 13, 9226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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Eingegangen: 07. Dezember 2022

Angenommen: 31. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36202-4

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