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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 572 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Labormaus hat enorme Einblicke in die Grundlagen der Physiologie des Zentralnervensystems von Säugetieren geliefert. In den letzten Jahren ist es möglich geworden, einzelne Neuronen, Glia- und Gefäßzellen in vivo abzubilden, indem am Kopf befestigte Präparate in Kombination mit Schädelfenstern verwendet werden, um lokale Aktivitätsnetzwerke im lebenden Gehirn zu untersuchen. Solche Ansätze waren auch ohne den Einsatz einer Vollnarkose erfolgreich und lieferten Einblicke in das natürliche Verhalten des Zentralnervensystems. Für das Auge, das ständig in Bewegung ist, ist dies jedoch noch nicht entwickelt. Hier charakterisieren wir ein neuartiges kopffixiertes Präparat, das eine hochauflösende adaptive optische Netzhautbildgebung auf Einzelzellebene bei wachen Mäusen ermöglicht. Wir enthüllen drei neue funktionelle Eigenschaften des normalen Auges, die bei der Anästhesie übersehen werden: 1) Hochfrequente Augenbewegung mit niedriger Amplitude der Maus, die nur im Wachzustand vorhanden ist. 2) Einzelzell-Blutfluss in der Netzhaut der Maus unter Anästhesie reduziert und 3) die Netzhaut der Maus verdickt sich als Reaktion auf eine Ketamin/Xylazin-Anästhesie. Hier zeigen wir die wichtigsten Vorteile des Wachverhaltenspräparats, das die Untersuchung der Netzhautphysiologie ohne Anästhesie ermöglicht, um die normale Netzhautphysiologie bei der Maus zu untersuchen.

Die Labormaus ist aufgrund ihrer Größe, Zugänglichkeit, ihres sequenzierten genetischen Katalogs und ihrer Fähigkeit, Aspekte menschlicher Krankheiten zu modellieren, ein unverzichtbares Modell für die biomedizinische Forschung. Insbesondere hat es die Untersuchung der Anatomie und Funktion des Säugetierauges ermöglicht, das abgesehen von der Größe und dem bemerkenswerten Fehlen einer Fovea in vielerlei Hinsicht dem menschlichen Auge ähnelt1. Um eine hochauflösende Netzhautbildgebung bei der Maus zu erreichen, ist in der Regel eine Anästhesie erforderlich, um das Präparat zu stabilisieren und Augenbewegungen zu unterdrücken, was eine Funktionsbeurteilung auf zellulärer Ebene nahezu unmöglich macht2. Einige Ansätze haben gezeigt, dass die Bildgebung der Netzhaut von Mäusen mit Handbeschränkung möglich ist3,4. Dieser Ansatz eignet sich jedoch nur für fotografische Zwecke mit nur einem Schnappschuss und bietet keine stabile optische Achse, die für funktionelle Messungen unerlässlich ist.

Die Verabreichung einer Vollnarkose sorgt für eine stabilisierte In-vivo-Vorbereitung und mildert die Augenbewegung; Es kann jedoch auch die normale physiologische Funktion verändern, wodurch die Interpretation von In-vivo-Messungen eingeschränkt wird, insbesondere derjenigen der Funktion des Zentralnervensystems (ZNS)5,6. Zu diesem Zweck haben Verhaltens- und physiologische Neurowissenschaftler kopffixierte Präparate entwickelt, um das Gehirn für die Elektrophysiologie und In-vivo-Mikroskopie7 zu stabilisieren, sodass keine Anästhesie erforderlich ist. Insbesondere haben Studien über verschiedene wichtige neurophysiologische Unterschiede im Wachzustand gegenüber dem Narkosezustand berichtet8,9. Eine weitere Konsequenz der Anästhesie für die Sehforschung besteht darin, dass sie die natürliche Augenbewegung aufhebt, die dem visuellen System einen räumlich-zeitlichen Kontrast verleiht. Die Unterdrückung der natürlichen Augenbewegung verändert grundlegend die räumlich-zeitliche Kinetik der Ganglienzellabgabe an den Nucleus geniculatum laterale, den Colliculus superior und Untersuchungen des visuellen Kortex an Mäusen10. Es gibt auch Berichte, dass die Fortbewegung in der Wachvorbereitung die physiologische Reaktion des visuellen Kortex11 erheblich verändert, die Mechanismen sind jedoch nicht vollständig geklärt. Daher könnte die Beibehaltung der Augenbewegung das Verständnis des okulomotorischen Verhaltens von Mäusen weiter voranbringen und insbesondere, wie biologische Augenbewegungen die grundlegende visuelle Physiologie beeinflussen und steuern können.

Zusätzlich zu den Vorteilen der Erhaltung der Augenbewegung und der Eliminierung von Störungen durch die Anästhesie kann die Bildgebung der wachen Maus die Netzhautbildgebung auch in mehreren weiteren Aspekten unterstützen. Erstens kann die Abbildung des wachen Tieres eine optische Trübung durch längere Narkose verhindern, was eine enorme Herausforderung für die Augenbildgebung bei der anästhesierten Maus darstellt12. Zweitens ist bei der Bildgebung der wachen Maus keine Thermoregulation erforderlich, die sich nachweislich auf die homöostatische Physiologie auswirkt13. Und schließlich behält die wache Maus die normale Augenklarheit bei, indem sie blinzelt und den Tränenfilm ständig auffrischt, ohne dass Kontaktlinsen oder Gleitmittel erforderlich sind, was zu Verhaltensstörungen oder natürlichen Sehstörungen führen könnte14.

Hier erkennen wir viele potenzielle Vorteile der Untersuchung der Netzhaut einer wachen Maus mit hoher Auflösung ohne Anästhesie und überwinden eine Reihe der oben genannten Einschränkungen, indem wir ein kopfgestütztes Präparat für die Netzhautbildgebung entwickeln und charakterisieren. Wir bieten eine vollständig 3D-gedruckte Open-Source-Apparatur zum Halten des Mauskopfes, um eine stabile Pupille mit einem über einem Rotationszylinder aufgehängten Körper bereitzustellen, der eine freie Bewegung und gleichzeitige Messung der Bewegungsgeschwindigkeit und des Bewegungsverhaltens ermöglicht. Wir messen die Stabilität der optischen Achse, die eine hochauflösende strukturelle und funktionelle Bildgebung der Netzhaut ermöglicht. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen, indem wir das Mausauge mit einem führenden kommerziellen multimodalen Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) und optischen Kohärenztomographie (OCT) abbilden. Anschließend demonstrieren wir die Vorteile der hochauflösenden Bildgebung mithilfe eines maßgeschneiderten Scanning-Light-Ophthalmoskops mit adaptiver Optik (AOSLO), um verschiedene Zellstrukturen der Netzhaut mit einer Auflösung im Mikrometerbereich sichtbar zu machen. Die Stabilität des Auges und die Bildqualität bei der wachen Maus werden sowohl für die SLO- als auch für die AOSLO-Bildgebung validiert. Mithilfe der Hochgeschwindigkeits-Zeilenscan-AOSLO-Hochgeschwindigkeits-Zeilenscan-AOSLO-Bildgebung15,16 entdecken wir eine zuvor übersehene Mikrotremor-ähnliche Augenbewegung. In dieser frühen Arbeit stellen wir mehrere wissenschaftliche Möglichkeiten vor, indem wir drei wichtige physiologische Veränderungen in der Netzhaut hervorheben, die durch Anästhesie hervorgerufen werden.

Der allgemeine Ansatz und Aufbau ist in Abb. 1a dargestellt. Der Schädel der Maus wurde durch eine befestigte Kopfplatte stabil gehalten. Die Y-förmige Kopfplatte wurde nach einem einzelnen chirurgischen Schnitt durch die Kopfhaut unter Narkose parallel zur anterior-posterioren Achse in der Mitte des Mausschädels implantiert (Abb. 1b). Alle Mäuse überlebten den Eingriff. Mäuse mit Kopfbedeckung zeigten normales Verhalten und behielten ein gesundes äußeres Erscheinungsbild mit gepflegtem Haarkleid und normalem Aktivitätsniveau bei. Es wurden keine Entzündungen oder andere Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Kopfplattenimplantation beobachtet. Auch das Gewicht aller Mäuse blieb vor und nach der Operation konstant. Innerhalb von drei Tagen nach der chirurgischen Platzierung der Kopfplatte gewöhnten sich kopfgestützte Mäuse in fünf Trainingssitzungen von 30–60 Minuten an die Vorrichtung. Die Y-förmige Kopfplatte war an einem festen Arm montiert, der über einem Rotationszylinder aufgehängt war, so dass die Mäuse sich frei nach vorne und hinten bewegen konnten. Nach dem Training und der Eingewöhnung in den kopffixierten Apparat zeigten die Mäuse keine Abneigung oder Rückzugsreaktion und behielten ihr normales Putzverhalten bei (Ergänzungsvideo 1), was weiter auf einen ruhigen Grundzustand ohne äußere Anzeichen von Stress hinweist17,18. Die Kopfplattenoperation ließ das Auge offen und zeigte einen normalen Blinzelreflex (Ergänzungsvideo 1).

a Kopfgestützte Vorbereitung für die Bildgebung der Netzhaut einer wachen, sich verhaltenden Maus. Eine chirurgisch implantierte Y-förmige Kopfplatte am Schädel der Maus schränkt die Kopfbewegung ein, während während der Bildgebung das Gehen auf einem Rotationszylinder ermöglicht wird. b Schematische Darstellung der Position der Kopfplatte in der Mitte des Mausschädels parallel zur anterior-posterioren Achse. c Ein Foto der kopfgestützten Maus, aufgenommen mit kommerziellem SLO. d Multimodales cSLO-Bild der Netzhaut bei wachen Mäusen mit fixiertem Kopf. Verschiedene Netzhautstrukturen werden sichtbar gemacht (links – rechts): Reflexions- und Autofluoreszenzbildgebung zeigen große oberflächliche Netzhautblutgefäße und Nervenfaserbündel sowohl unter den NIR-Kanälen (oben) als auch unter den blauen Kanälen (unten). Fluoreszenz-Co-Registrierung der NIR-angeregten Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) oberflächlicher Blutgefäßnetzwerke (dargestellt als rote Pseudofarbe) mit blau angeregten fluoreszenzmarkierten Immunzellen (dargestellt als grüne Pseudofarbe) in einer transgenen CX3CR1-Maus. ICGA des tiefen choroidalen Blutgefäßnetzwerks. e OCT-Würfel und ein repräsentativer b-gescannter Querschnitt, abgebildet bei einer kopfgestützten wachen Maus. f AOSLO-Bilder zeigen multimodale Fähigkeiten. Links: Das konfokale Reflexionsbild zeigt Nervenfaserbündel und Netzhautkapillaren. Mitte: Phasenkontrastbildgebung einer Mikrozyste und eines Zweigs retinaler Blutgefäße. Rechts: Fluoreszenzbild einer YFP-markierten retinalen Ganglienzelle mit hervorgehobenen Dendriten und Axonen.

Das kopfgestützte Gerät ermöglichte eine qualitativ hochwertige strukturelle und funktionelle Netzhautbildgebung unter Verwendung kommerzieller SLO- und OCT-Bildgebungsplattformen ohne die Hilfe adaptiver Optik (Abb. 1d, e und Zusatzvideo 3). Mit dem kommerziellen SLO + OCT-System (Heidelberg Spectralis, Heidelberg Engineering, Deutschland) waren alle führenden Fluoreszenz-, Autofluoreszenz- und Reflexionsbildgebungsmodalitäten möglich. Mittels Reflexion wurden die wichtigsten oberflächlichen Blutgefäße und Nervenfaserbündel der Netzhaut sowohl im NIR- als auch im Blaukanal sichtbar gemacht. Gängige Angiographie-Kontrastmittel könnten auch bei wachen Mäusen verwendet werden, um eine Natrium-Fluorescein-Angiographie (FA) mit klarer Arteriolen-, Venolen- und Kapillardarstellung der Netzhautzirkulation mittels 488-nm-Anregung sowie ~500-nm-Langpassfluoreszenz darzustellen. Die Indocyaningrün-Angiographie (ICGA) mit NIR-Licht zeigte sowohl die oberflächliche Netzhautzirkulation als auch eine gute Penetranz zur Visualisierung der Aderhautzirkulation. Die Visualisierung der Aderhaut ist bei der C57BL6/J-Maus besonders schwierig, da das RPE dicht pigmentiert ist. Um das Potenzial für die Abbildung transgen markierter Fluoreszenz zu zeigen, haben wir auch fluoreszierende Mikroglia mithilfe von CX3CR1-Mäusen mit einem verstärkten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) in Zellen abgebildet, die den Chemokin-CX3-Rezeptor 1 enthalten. In allen SLO-Bildgebungsmodalitäten (Fluoreszenz und Reflexion) ist die einzelne -Bildkontrast und Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) reichten aus, um die Registrierung mit einer Bildrate von bis zu 8,8 Hz mit der integrierten Auto-Registrierungssoftware (Zusatzvideo 2) durchzuführen. Die En-Face-Registrierung ermöglichte die B-Scan-Registrierung in Echtzeit für volumetrische OCT-Würfel und verbesserte das SNR durch Mittelung mehrerer Bilder (ART, automatische Echtzeitverfolgung)19. Wir haben einen 3D-OCT-Würfel mit 96 B-Scans abgebildet. Mithilfe der integrierten Echtzeitregistrierung und ART zeigte der OCT-Würfel eine klare Abgrenzung der Netzhautschichten, die mit der unter Anästhesie erreichten vergleichbar war, trotz verbleibender Blickverschiebungen und Augenbewegungen bei der Erfassung des vollständigen Würfels.

Eine große Herausforderung für die hochauflösende Bildgebung der wachen Netzhaut einer Maus besteht darin, dass der Bildstrahl, der in die Pupille des Mausauges (~2 mm) eintritt, empfindlich auf Kopf- und Augenbewegungen reagiert. Fehlausrichtungen der Pupillen können zu Clipping und Vignettierung führen, die die Wellenfronterkennung erheblich beeinträchtigen, das Bild verwischen und zu einer instabilen Lichtabgabe/-sammlung für Funktionsmessungen führen. Für die meisten hochauflösenden Anwendungen ist eine vollständig erweiterte Pupille wünschenswert, da sie die numerische Apertur (NA ~ 0,49) maximiert und dadurch die Bildauflösung und die Lichtsammeleffizienz verbessert. Allerdings ist auch Stabilität erforderlich, um die optische Pupille des Instruments auf die Pupille des Tieres auszurichten. Um die Stabilität der optischen Achse für die Netzhautbildgebung zu quantifizieren, wurde die Austrittspupille des Auges von fünf wachen Mäusen über 20 Minuten lang mit SLO abgebildet. Die Pupille wurde anhand der SLO-Bilder mithilfe einer speziell entwickelten Software verfolgt und segmentiert (Abb. 2a und Zusatzvideo 3). Die Mauspupille wurde verfolgt, um die räumliche Beschneidung des Strahls basierend auf einem simulierten Bildstrahl mit 2,0 und 1,6 mm Durchmesser zu quantifizieren (Abb. 2b, c). Mit dem 2,0-mm-Strahl zeigten vier Mäuse eine ausgezeichnete Pupillenstabilität, wobei im Zeitverlauf <1 % der durchschnittlichen Fläche der Pupille abgeschnitten wurde. Ein Tier zeigte mehr Strahlbeschneidung (6,65 %). Wir stellten fest, dass es sich hierbei um einen Ausreißer aufgrund einer suboptimalen Kopfplattenoperation handelte, die zu einer unvollständigen Augenöffnung aufgrund einer geringfügigen Erschlaffung der Augenlider führte. Bei Verwendung des kleineren 1,6-mm-Bildgebungsstrahls zeigten alle Mäuse eine vernachlässigbare Strahlbeschneidung, die 0,112 ± 0,18 % der Pupillenfläche ausmachte (Mittelwert ± SD, n = 5 Mäuse). Um die zeitlichen Auswirkungen der Strahlbeschneidung (der Zeitanteil, in dem der Strahl um >10 % beschnitten wurde) zu bewerten, haben wir SLO-Videos ausgewertet, die mit 8,8 Bildern pro Sekunde (fps) aufgenommen wurden. Wir fanden heraus, dass 94,75 ± 11,13 % der Rahmen für den 2,0-mm-Träger (Mittelwert ± Standardabweichung, N = 5 Mäuse) und 99,78 ± 0,30 % der Rahmen für den 1,6-mm-Träger entclippt waren. Der geringe Anteil der Pupillenbeschneidung in der räumlichen oder zeitlichen Analyse wurde hauptsächlich dem Blickverhalten der Maus und nicht der mangelnden Stabilität der Kopfplattenpräparation zugeschrieben. Die Pupillenstabilität wurde ebenfalls untersucht, indem die Pupillenposition relativ zur gleichzeitig aufgezeichneten Ganggeschwindigkeit verglichen wurde. Es gab keine Korrelation zwischen der Strahlbeschneidung oder der Pupillenzentrierung mit dem Fortbewegungsverhalten. Dies deutet darauf hin, dass die Pupillenstabilität auf eine stabil fixierte Kopfplatte zurückzuführen ist (Abb. 2d). Sowohl die räumliche als auch die zeitliche Analyse deuten darauf hin, dass die Pupille selbst bei Fortbewegung bis zu 0,8 m/s (ungefähr ein Viertel der Höchstgeschwindigkeit einer ungebremsten Maus) stabil ist. Daher eignet sich die Vorbereitung des wachen Mausauges günstig für eine kontinuierliche Netzhautbildgebung, die die funktionelle Optophysiologie unter natürlicheren Bedingungen erleichtert.

a Bild eines Mausschülers, aufgenommen mit kommerziellem SLO. Der gelbe Vollkreis zeigt die verfolgte Pupillengrenze des Auges an. Cyanfarbene durchgezogene und gestrichelte Kreise zeigen jeweils die simulierte Bildgebungsbake mit 2 bzw. 1,6 mm Durchmesser eines hochauflösenden Bildgebungssystems an. b Die Kartierung der Pupillenpersistenz zeigt eine stabile Pupille über 20 Minuten bei Verwendung von Systempupillen mit 2 mm (durchgezogen) und 1,6 mm (gestrichelt) Durchmesser. c Die linke Y-Achse zeigt die Pupillenbeschneidung im Bereich und die rechte Y-Achse zeigt den Anteil der nicht beschnittenen Bilder (<10 % Fläche) während der 20-minütigen Bildgebungssitzung (N = 8956 Bilder). d Bei der Korrelation der Augenbewegung der Maus und der Ganggeschwindigkeit wurde keine offensichtliche Korrelation beobachtet, was unabhängig vom Bewegungszustand der Maus eine konsistente optische Stabilität zeigt.

Zusätzlich zur Bewegung der Pupille können Augenbewegungen, einschließlich Blickwechsel und Blinzeln, stabile Bildgebungsansätze stören. Wir haben daher die Blickverschiebung und das Blinzeln quantifiziert, indem wir die Netzhaut bei fünf wachen Mäusen 20 Minuten lang mit SLO abgebildet haben. Im Vergleich zu Menschen war das Blinzeln bei Mäusen weitaus seltener (1,78 ± 0,8 Blinzeln/Minute, n = 5 Mäuse) als bei Menschen (~20 Blinzeln/Minute)20. Die gemessene Dauer des Augenblinzelns der Maus betrug <340,9 ms, was etwa drei Frames im SLO-System entspricht. Die seltenen Blinzelereignisse bei Mäusen ermöglichen eine unterbrechungsfreie Bildgebung, die über das hinausgeht, was bei der Bildgebung der menschlichen Netzhaut möglich ist. Blickverschiebungen wurden durch Verfolgung von Netzhautmerkmalen über ein 55°-FOV (8,8 fps) quantifiziert. Mäuse betrachteten die visuelle Szene des Versuchsaufbaus frei mit seltenen, aber gerichteten Augenbewegungen. Dies wurde unabhängig von der Kopfausrichtung gemessen, da der am Kopf befestigte Apparat den Blick nur auf Augenbewegungen beschränkte. Die meisten Blickverschiebungen auf der Netzhaut erfolgten in der horizontalen Achse und erstreckten sich über einen beobachteten Spitze-zu-Spitze-Bereich von ±18,00˚ FOV unter freien Sichtbedingungen. Dies war groß im Vergleich zu ±3,44˚ der verfolgten Bewegung in der vertikalen Dimension (Abb. 3a und Zusatzvideo 3). Ähnlich wie in früheren Studien21 stellten wir fest, dass die vorherrschenden Blickwechsel >5˚, schnell (~50˚/s) und selten waren (~7 pro Minute bei Mäusen, verglichen mit mehreren Sakkaden pro Sekunde beim Menschen). Da Mäusen eine Fovea fehlt, handelt es sich bei diesen Blickverschiebungen nicht um echte Sakkaden, die das Bild wieder auf die Fovea zentrieren22, sondern möglicherweise um eine Neuverteilung der visuellen Szene auf Bereiche, die dichter mit Photorezeptoren oder kleineren rezeptiven Ganglienzellenfeldern bestückt sind und sich in der Nähe der optischen Achse befinden des Auges23. Zwanzig Minuten halbkontinuierlicher Videoverfolgung der Netzhaut der Maus zeigte das Blickverhalten ein gehäuftes Muster der Persistenz über mehrere bevorzugte Blickrichtungen, was auf eine natürliche Ruheposition des Auges oder eine bevorzugte Blickrichtung basierend auf visuellen Merkmalen im Laborraum hindeutet. Um die Beständigkeit der Blickpositionen zu bestimmen, wurden die Daten dann alle 10 s aufgeteilt und auf die lokale mittlere Position normiert. Mithilfe dieser Analyse stellten wir fest, dass die Netzhautposition innerhalb der 10-s-Fenster in 80,02 ± 0,065 % der Fälle innerhalb von 5˚ des Sehwinkels blieb, was dem typischen Videoaufnahmefenster der hochauflösenden AOSLO-Bildgebung entspricht. Dies ist für hochauflösende Bildgebung relevant, da das abgedeckte Feld für die AOSLO-Bildgebung typischerweise 5˚ beträgt, was darauf hindeutet, dass die Offline-Bildregistrierung die Bewegung durch Streifen- oder Rahmenregistrierungsansätze ohne „Frame-Out“-Fehler korrigieren kann, die eine Bildregistrierung auf der Grundlage gemeinsamer Merkmale oder machen Kreuzkorrelationsansätze herausfordernd24.

a Die Blickposition der Maus wird durch Verfolgung der Netzhautversätze gemessen. Rechts: Verfolgte Blickposition einer kopfgestützten Maus über 20 Minuten, überlagert mit einem repräsentativen Bild der Netzhaut. Links: Die 20-minütige Bewegungsspur zeigt Blickverschiebungen in horizontaler (oben) und vertikaler (Mitte) Richtung. Gleichzeitig aufgezeichnete Ganggeschwindigkeit mit einem Drehgeber am Rad (unten). b Blickpositionen aller fünf Mäuse normalisiert für alle 10 Sekunden Schiebefenster über 20 Minuten. Histogramme der Blickpositionsverteilung, die der horizontalen und vertikalen Achse überlagert sind, zeigen eine hohe Wahrscheinlichkeit von Netzhautversätzen <5° (gekennzeichnet als gestricheltes Kästchen) innerhalb des 10-Sekunden-Bildfensters. c Korrelationen der Blickgeschwindigkeit der Maus und der Ganggeschwindigkeit. Das untere Feld zeigt die Vergrößerung des fertigen Datensatzes, der zur Visualisierung oben als graues Kästchen markiert ist.

Gleichzeitig wurden auch Bewegungsdaten mit dem Drehgeber aufgezeichnet, um den möglichen Zusammenhang zwischen Fortbewegung und Blickverhalten zu untersuchen. Ganggeschwindigkeit und Augenbewegung weisen schwache negative Korrelationen auf, mit Ausnahme von Maus Nr. 4, die eine schwache positive Korrelation aufwies. (R = 0,0226; 0,0030; 0,1294; 0,0060; 0,0135). Wir beobachteten keine offensichtliche Veränderung des Blickverhaltens, während die Tiere ruhten oder sich bewegten (Abb. 3c). Dies deutet nicht nur auf stabile Bildaufzeichnungen unabhängig von der Fortbewegung der Mäuse hin, sondern auch auf das Fehlen verstärkter oder unterdrückter Augenbewegungen entsprechend dem Gang.

Der Mangel an Blinzeln in Kombination mit der Stabilität der optischen Achse und der Pupillenöffnung im wachen Mausauge machte es möglich, Wellenfronterkennung und Wellenfrontkorrektur mithilfe adaptiver Optik mit geschlossenem Regelkreis durchzuführen. Unter Verwendung der 2,0-mm-Eintrittspupille des erweiterten Mausauges stellten wir fest, dass die Wellenfront-Erkennungspunkte von Hartman-Shack (HS) hell blieben und eine minimale Streuung aufwiesen, was eine Korrektur über mehr als 75 Minuten ermöglichte (Abb. 4a – d). Dieses Präparat war mit dem optimalen anästhesierten Präparat vergleichbar14,25. Die stabile HS-Spot- und Pupillenposition ermöglichte eine aktive Korrektur der adaptiven Optik mit vernachlässigbarer Pupillenbeschneidung. Die an den verformbaren Spiegel angelegten Wellenfrontkorrekturspannungen lagen innerhalb des dynamischen Bereichs des verformbaren Spiegels, was auf einen ausreichenden Hub hinweist. Mit der AO-Korrektur mit geschlossenem Regelkreis blieben der Bildkontrast und das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der Netzhaut über Aufzeichnungen von mehr als einer Stunde relativ stabil, ohne dass sich die Bildqualität im Laufe der Zeit merklich verschlechterte (Abb. 4e).

a, b AO-korrigierte Bildgebung bei anästhesierten (a) und wachen (b) Mäusen über 75 Minuten. Oben: Mit HSWS aufgenommenes Wellenfront-Spotgramm der Schülerin. Mitte: mittleres Spotintensitätsprofil der mit dem orangefarbenen Rechteck gekennzeichneten Region. Unten: AOSLO-Bild. Die Intensität der mittleren Punktmuster wurde jeweils auf die Spitzenintensität zu den Zeitpunkten 0 in den Wach- und Anästhesiedaten normiert. c, d Vergleich der Intensitätsprofile der gemittelten Spots (in a, b als gestrichelte Linien markiert) bei 0 Min. und 75 Min. Alle Intensitätsprofile wurden jeweils auf ihre Spitzenwerte normiert. Bei der anästhesierten Maus war der Fleck in 75 Minuten leicht verbreitert, während die wache Maus relativ stabil war. e Diagramm der mittleren Spitzenintensität über die Zeit. Die wache Maus zeigte bei optimaler Vorbereitung eine relativ stabile mittlere Spitzenintensität, ebenso wie die anästhesierten Mäuse.

Nach der AO-Korrektur zeigte die hochauflösende AOSLO-Bildgebung zelluläre Netzhautstrukturen in der wachen Maus und spiegelte damit das wider, was in früheren Studien möglich war, jedoch ohne Anästhesie (Abb. 1f). Mithilfe der konfokalen 796-nm-NIR-Bildgebung waren Strukturen wie einzelne Nervenfaserbündel und Kapillaren mit einer Größe von weniger als 5 µm14 sichtbar. Mittels NIR-Phasenkontrastbildgebung wurden durchscheinende Strukturen wie einzelne Blutzellen16 und Gefäßwände16 sichtbar gemacht. Dies ermöglichte eine markierungsfreie Blutflussmessung (unten beschrieben). Um die Fluoreszenzfähigkeit zu zeigen, haben wir die Thy-1 YFP-markierten Ganglienzellen und ihre dendritischen Dorne14 unter einer Anregung von 488 nm abgebildet. Die AOSLO-Bilder aller drei Bildgebungsmodalitäten zeigen Kontrast und Auflösung, die mit denen vergleichbar sind, die zuvor unter anästhesierten Mäusen aufgenommen wurden. Alle NIR-Phasenkontrast-, konfokalen Reflexions- und Fluoreszenzbildgebungsmodalitäten wurden unter Verwendung sicherer Lichtleistungsniveaus durchgeführt, ohne dass Verhaltensstörungen durch das Bildlicht beobachtet wurden (200–500 µW an der Hornhaut für NIR, 220–330 µW an der Hornhaut für). Fluoreszenz). Während man nicht erwartet, dass NIR-Wellenlängen für die Mäuse sichtbar sind, löste selbst die Verwendung heller sichtbarer Wellenlängen kein Zucken oder übermäßiges Blinzeln bei der Maus aus, was darauf hindeutet, dass diese Lichtstärken keinen offensichtlichen Stress oder Photophobie hervorrufen. Die gesamten Augenbewegungen in bevorzugten Blickrichtungen wurden im Allgemeinen innerhalb von 5° der Netzhautbewegung gehalten, was bedeutet, dass „Frame-Out“-Fehler bei der Bildregistrierung selten auftraten. Die verbleibenden hochfrequenten Korrekturen mit geringer Stärke wurden beobachtet und korrigiert (Zusatzvideo 5).

Mithilfe der AOSLO-Bildgebung stellten wir fest, dass die Netzhautbewegung durch Blickverschiebungen, langsame Drifts und eine bisher nicht berichtete hochfrequente Augenbewegung mit niedriger Amplitude bei der wachen Maus gekennzeichnet war. Eine visuelle Untersuchung der Videoratendaten zeigt, dass einzelne Bilder ein schnelles Wackeln/Scheren innerhalb einzelner Bilder (~40 ms, weiter unten beschrieben) und größere Augenbewegungen aufweisen, die das Feld verschieben. Ohne Korrektur führt eine solche Augenbewegung zu Bewegungsverzerrungen/-unschärfen, selbst wenn die Bildgebung mit beugungsbegrenzten Optiken erfolgt (Zusatzvideo 5). Eine streifenbasierte Registrierung parallel zur schnellen Scanachse (15 kHz)26 wurde eingesetzt, um die zeilenweise Bewegung zu messen und zu korrigieren, die in der AOSLO-Bildgebung der wachen Maus beobachtet wurde (Abb. 5a und Zusatzvideo 6). Um die Vorteile des streifen-/linienbasierten Registrierungsansatzes zu verdeutlichen, zeigen wir eine digitale Nachbearbeitungskorrektur der schnellen Augenbewegung mit deutlich verbessertem Kontrast und Schärfe feiner Detailmerkmale im Vergleich zum Rohdaten- und Starrkörper-Frame-Registrierungsansatz ( Abb. 5b). Alle hier vorgestellten Fluoreszenzbilder verfügen über ausreichend Kontrast, um eine Streifenregistrierung in jeder hochauflösenden Bildgebungsmodalität durchzuführen, ohne dass eine Strategie zur doppelten Registrierung erforderlich ist24. Wir zeichneten auch ein Querschnittsprofil spezifischer Zielmerkmale in jeder Modalität auf und zeigten eine Verbesserung des Kontrasts und der Schärfe (Abb. 5c). Die Streifenregistrierung ergab feine Details der Dendriten von YFP-markierten Ganglienzellen der Netzhaut, Gefäßkontrast sowie einen höheren Kontrast von Nervenfaserbündeln auf der Netzhautoberfläche (Abb. 5c). Darüber hinaus verbesserte die streifenbasierte Bewegungskorrektur den Kontrast und die Schärfe des Bewegungskontrasts, wodurch die Perfusion des Blutflusses, der sehr empfindlich auf Bewegungsartefakte reagiert, genauer dargestellt wird27.

a Demonstration der Streifenregistrierung mithilfe einer YFP-markierten Ganglienzelle der Netzhaut, aufgenommen von einer kopfgestützten wachen Maus. Von links nach rechts: manuell ausgewählter Referenzrahmen mit der geringsten Verzerrung, durch die Augenbewegungen verzerrtes AOSLO-Rohbild, registriertes Bild und die Augenbewegungsspur in horizontaler und vertikaler Richtung. b Gemittelte Bilder von vier Modalitäten ohne Registrierung (oben), Rahmenregistrierung (Mitte) und Streifenregistrierung (unten). Von links nach rechts: Fluoreszenzbild einer YFP-markierten retinalen Ganglienzelle; Phasenkontrastbild eines großen Blutgefäßes (Venule) der Netzhaut; Bewegungskontrastbild des Blutgefäßes; Konfokales Reflexionsbild von Kapillaren und Nervenfaserbündeln. c Die Intensitätsprofile von drei Registrierungsstrategien, deren Orte in (b) als weiße gestrichelte Linien markiert sind. Zum Vergleich zeigen die grauen Streifen die Breite der Hauptbildmerkmale an, während die Pfeile andere Nebenmerkmale anzeigen. In b, c zeigt die Streifenregistrierung einen verbesserten Bildkontrast und SNR in allen vier Bildgebungsmodalitäten.

Sowohl im kommerziellen SLO als auch im benutzerdefinierten AOSLO beobachteten wir eine schnelle Augenbewegung mit geringer Amplitude, die dazu führte, dass einzelne Bilder Wackeln und Scheren innerhalb des Bildes aufwiesen (Ergänzungsvideo 4, 5). Solche Effekte treten häufig bei Scangeräten oder solchen mit „Rolling-Shutter“ auf, wenn die Bewegung die Bildrate der Kamera überschreitet. Die Bewegung war kein Artefakt des Bildgebungssystems, da der Effekt bei der Verabreichung der Anästhesie zum Schweigen gebracht wurde (Zusatzvideo 5). Die Augenbewegung in Richtung orthogonal zum Gefäß kann durch Verfolgung der Form des Scherprofils quantifiziert werden (Abb. 6). Mit diesem Ansatz haben wir die schnelle Augenbewegung quantifiziert, die unseres Wissens bei der wachen Maus nicht beobachtet wurde (Abb. 6a, b und Zusatzvideo 8)15,16. Eine Fourier-Transformation der Augenbewegungsspur (Abb. 6c) ergab zwei markante Peaks bei niedriger Frequenz, jeweils bei 2 und 9 Hz. Diese Spitzen entsprechen den charakteristischen Atemfrequenzen28 und Herzfrequenzen29 der wachen Maus. Allerdings beobachteten wir auch ein Leistungsband in den höheren Frequenzbereichen über 150 Hz. Die Fourier-Transformation der Augenbewegungsgeschwindigkeitsspur (Abb. 6d) zeigt ein Geschwindigkeitsband nahe 100 Hz mit einer Bandbreite (30–150 Hz). Bei foveierten Arten ist dieses Frequenzband charakteristisch für Augenzittern30; Allerdings ist dies hier bemerkenswert, da Mäusen eine Fovea fehlt und sie eine Sehschärfe von 0,5 c/Grad31 haben. Die hochfrequente Augenbewegungsamplitude betrug etwa 6 µm, was weit unter der Auflösung herkömmlicher ophthalmologischer Geräte liegt, was möglicherweise erklärt, warum sie bisher übersehen wurde.

a Messung von Augenbewegungen mit geringer Amplitude, aber hoher Frequenz mittels zeilengescannter Bildgebung über ein großes Blutgefäß (Vene) der Netzhaut. Links: Kartesisches Bild der Vene. Der schwarze Pfeil zeigt die Platzierung der zeilengescannten Bildgebung an. Rechts: zeilengescanntes Bild der Vene mit überlagerter Bewegungsspur als weiße Linie. b Oben: Spur eines hochfrequenten Augenzitterns, hervorgehoben mit einem Hochpassfilter (>30 Hz). Unten: Spur der Augenbewegungsgeschwindigkeit. c Fourier-Transformation der Augenbewegungsspur (ungefiltert). Es wurden Leistungen bis zu 200 Hz beobachtet. Bei 2 Hz (120 Schlägen pro Minute) und 9 Hz (540 Schlägen pro Minute) wurden zwei markante niederfrequente Spitzenwerte beobachtet, die möglicherweise auf die Atmung und den Herzschlag zurückzuführen sind. d Fourier-Transformation der Augenbewegungsgeschwindigkeit. Es wurden erhöhte Leistungen bei 30–200 Hz beobachtet, was auf die Bandbreite des Augenzitterns hinweist.

Unter Anästhesie ist es aufgrund der Verträglichkeit der Anästhesie, der Entwicklung einer vorderen Trübung oder der Wahrscheinlichkeit einer Erholung nach anhaltender Anästhesie selten, dass das Mausauge länger als 2 Stunden am Stück abgebildet werden kann32,33,34. Daher ermöglicht die Wachvorbereitung halbkontinuierliche Bildgebungssitzungen, die sich über viele Stunden erstrecken. Um diese Fähigkeit und Qualität der Bildgebung über lange Zeiträume hinweg zu demonstrieren, wurde dieselbe wache, sich verhaltende Maus 10 aufeinanderfolgende Stunden lang im Abstand von 1 Stunde abgebildet (Abb. 7a). Die 10-stündige Bildgebungszeit umfasste sowohl die normalen Wach- als auch die Schlafperioden des zirkadianen Hell-Dunkel-Zyklus (die ersten 4 Stunden entsprechen den hellen Stunden im Vivarium und die restlichen 6 Stunden entsprechen den dunklen Stunden). Trotz gelegentlicher Blickverschiebungen, die das Bildfeld auf natürliche Weise verändern, konnten wir mit einer Genauigkeit von <3˚ zum gleichen Bildfeld zurückkehren, indem wir die Ausrichtung der Maus manuell anpassen, um bei jeder Bildgebungssitzung Konsistenz zu gewährleisten (Abb. 7b und Zusatzvideo 7). Um eine solche Anwendung zu zeigen, haben wir die hochfrequente Augenbewegung als Funktion der Tageszeit über einen Zeitraum von 10 Stunden untersucht. Die Amplitude der schnellen Augenbewegung blieb über 10 Stunden konstant mit einem Mittelwert von 5,95 µm oder 10,50 Bogenminuten (Abb. 7c). Die Leistungsspektren des Allzeitpunkts deuteten auch auf eine konsistente Frequenzbandbreite der Bewegungsgeschwindigkeit hin (Abb. 7d, e und Zusatzvideo 9).

eine 10-stündige longitudinale AOSLO-Bildgebung bei derselben kopfgestützten, wachen, sich verhaltenden Maus. Die Bildgebung dauerte 11 Stunden, mit einer 10-minütigen Bildgebungssitzung alle 1–1,5 Stunden. Es wurden repräsentative kartesische AOSLO-Bilder derselben Vene bei jeder Sitzung gezeigt. b Die Montage kartesischer Bilder mit farbcodierten Rändern und Zeitstempeln zeigt die Fähigkeit, in verschiedenen Bildgebungssitzungen über einen Zeitraum von 10 Stunden zur gleichen Vene zu navigieren und diese zu lokalisieren. c Mittlere Amplitude des Augenzitterns, gemessen aus den Zeilenscandaten derselben Venule über 10 Stunden. Der Fehlerbalken gibt die Standardabweichung der Augenbewegungsamplitude über alle Zeitpunkte (N = 15.000 Linien) an. d FT der Augenbewegungsgeschwindigkeitskurve mit identischen Leistungsspektren über 10 Stunden mit konsistenter Bandbreite von 30–200 Hz. e Eine weitere perspektivische Ansicht derselben Daten wie (d). Die überlagerte graue Linie zeigt den Durchschnitt aller Leistungsspektren.

Hochfrequente Augenbewegungen wurden bei einer Maus zunächst im Wachzustand und dann nach ca. 2-stündiger K/X-Injektion gemessen. Wir beobachteten, dass die hochfrequente Augenbewegung nach Einleitung der Anästhesie schnell entfernt wurde (Abb. 8a, b und Zusatzvideo 10). Die Quantifizierung dieses Effekts ist in Abb. 8 dargestellt; Die sichtbare Abschwächung hochfrequenter Bewegungen ist jedoch auch im Zusatzvideo 5 erkennbar, wo dieselben Netzhautstellen innerhalb von Minuten nach der K/X-Injektion gezeigt werden. Die Augenbewegung betrug über 80 Minuten weniger als 10 µm, was darauf hindeutet, dass nicht nur Blickpositionsverschiebungen unterdrückt werden, sondern auch hochfrequente, tremorähnliche Bewegungen. Achtzig Minuten nach der K/X-Injektion wurde ein leichtes Zucken und Zittern im Gesicht beobachtet. Sowohl die schnelle als auch die blickabhängige Augenbewegung kehrten allmählich zu den Ausgangsbedingungen zurück (Abb. 8c).

a Die Messung der Augenbewegung zeigt das Fehlen von Augenbewegungen unter tiefer Anästhesie und tritt dann unter flacher Anästhesie wieder auf, jedoch mit geringerer Geschwindigkeit im Vergleich zum Wachzustand. Der Farbcode gibt den Zeitraffer der Bildgebung an, wobei Grün der Wachzustand, Magenta der tiefe Anästhesiezustand und Cyan der flachere Anästhesiezustand ist. b Profile der Augenbewegungsgeschwindigkeit und c Seine Leistungsspektren zu jedem Zeitpunkt zeigen nicht nur eine relativ geringere Geschwindigkeit, sondern auch eine geringere Frequenzbandbreite unter flacher Anästhesie im Vergleich zum Wachzustand.

Der Blutfluss wurde mithilfe der zuvor beschriebenen Technik bei Mäusen mit Kopfstützen gemessen15. Kurz gesagt, wenn eine zeilenweise Bildgebung über einem Blutgefäß durchgeführt wird, erzeugt die fließende Blutzelle eine abgewinkelte Flugbahn im Raum-Zeit-Bild, was auf eine Positionsänderung über die Zeit hindeutet, die durch den Einfallswinkel des Strahls über das Gefäß skaliert wird15. Die Geschwindigkeit der Blutzellen kann durch Messung der Steigung der Blutzellenprofile quantifiziert werden (Abb. 9a und Abb. S6). Es wurde festgestellt, dass der Fluss pulsierend war (Abb. 9b), jedoch mit unterschiedlichen Frequenzen und Geschwindigkeiten, die der variablen Herzfrequenz bei Anästhesie (481 und 758 Hz bei zwei wachen Mäusen) entsprachen, was den viel höheren Herzfrequenzen35 im Vergleich zu denen entspricht, die bei anästhesierten Mäusen gemessen wurden ( 271,2 ± 1,2 Hz, n = 5 Blutgefäße von drei Mäusen). Der Blutfluss in einer einzelnen Venole war 20 Minuten nach der Anästhesie im Vergleich zum Ausgangswert (1,56 bis 0,89 µL/min) um 43 % reduziert (Abb. 9c). Unabhängige Messungen zeigten eine abrupte Verengung des Gefäßdurchmessers unmittelbar nach der K/X-Injektion, während die Änderung der Blutgeschwindigkeit zu Beginn geringfügig war, sich aber mit der Zeit nach 20-minütiger K/X-Injektion erheblich verringerte. Diese beiden Parameter zeigten keine gleichwertigen Veränderungen, was die Bedeutung direkter Messungen unterstreicht, um ein vollständiges Bild des Blutflusses und seiner Regulierung zu erhalten36. Während die Augenbewegung (siehe oben) 80 Minuten nach der K/X-Induktion allmählich zurückkehrt, blieb der Blutfluss niedrig (0,66 µL/min), was 58 % unter dem Ausgangswert lag. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Rückkehr der Augenbewegung der Rückkehr des Netzhautblutflusses vorausging, was darauf hindeutet, dass die Rückkehr der physiologischen Funktion bei derselben Maus nach K/X-Anästhesie unterschiedlich schnell erfolgt. Flussmessungen der wachen Mäuse (n = 5 Gefäße von drei Mäusen) wurden auch mit zuvor gemeldeten Daten unserer Gruppe an anästhesierten Mäusen (n = 123 Gefäße von 20 Mäusen, Abb. 9d) verglichen15,19. Obwohl die Geschwindigkeit einzelner Gefäße unter Narkose verringert war, stellen wir fest, dass das Verhältnis zwischen Fluss und Gefäßdurchmesser insgesamt im Allgemeinen ähnlich war. Angepasste Modell-Durchmesser-Fluss-Kurven (ausführlich unter „Methoden“) zeigen geringfügige Gesamtunterschiede im gesamten Blutfluss.

a Zeilengescanntes Bild desselben großen Blutgefäßes in der Netzhaut einer Maus im Anästhesie- (oben) und Wachzustand (unten). Erkannte fließende einzelne Blutzellen wurden mit Linien markiert, deren Farbcode ihre Geschwindigkeit darstellt. b Gemessene Blutflussgeschwindigkeiten der in (a) gezeigten Daten. Pulsatile wurden sowohl in den Wach- als auch in den Anästhesiedaten beobachtet. Bei der wachen Maus wurden eine höhere Herzfrequenz und Flussgeschwindigkeit beobachtet. c Der gemessene Blutfluss in einem Gefäß über die Zeit zeigt die Unterdrückung des Blutflusses unter Narkose. d Der bei wachen Mäusen gemessene Einzelzellblutfluss (grün, n = 5 Gefäße, 3 Mäuse) wird mit einer Population anästhesierter Mäuse (lila, n = 123 Gefäße, 20 Mäuse) verglichen. Die Kurven des Strömungsdurchmessermodells werden an die Daten angepasst.

Wir haben die Netzhautmorphologie, die vom wachen bis zum anästhesierten Zustand variierte, mithilfe der OCT bei vier Mäusen gemessen. Alle Mäuse wurden im oberen temporalen Quadranten des rechten Auges mit einem Sichtfeld von 30° abgebildet. Wir beobachteten, dass die Mäuse, die einer Anästhesie unterzogen wurden, innerhalb von zwei Stunden eine erhebliche Netzhautverdickung zeigten, während dies bei den Mäusen im Wachzustand nicht der Fall war (Abb. 10a). Die gesamte Netzhautdicke (TRT) wurde mit einer benutzerdefinierten Software aus den 3D-OCT-Würfeln quantifiziert (Abb. 10b). Die Messungen jedes Datenpunkts sind in Abb. S8 dargestellt. 80–110 Minuten nach der Injektion erreichte die Netzhautdicke bei anästhesierten Mäusen einen maximalen Anstieg von 8,0 ± 4,1 μm (n = 4 Mäuse) mit einer durchschnittlichen Verdickung von 3,9 ± 2,0 % (p = 0,034, Abb. 10c), ohne dass dies signifikant war Eine Verdickung wurde in der Netzhaut wacher Kontrollmäuse beobachtet (p = 0,179, n = 4 Mäuse). Der Verdickungseffekt setzte sich zum letzten Zeitpunkt der Messung fort. Die En-face-Karte der TRT-Änderung deutete auch darauf hin, dass ein solcher Verdickungseffekt über alle Netzhautregionen und Exzentrizitäten hinweg gleichmäßig war (Abb. 10d, e).

a Längs-OCT-Bildgebung der Netzhaut einer Maus im wachen und anästhesierten Zustand. Im Zusammenhang mit der Zeitspanne nach der Injektion der K/X-Anästhesie wurde eine Verdickung der Netzhaut beobachtet. b Gesamte Netzhautdicke (TRT), gemessen anhand der OCT-Würfel. Es zeigt einen erheblichen Verdickungseffekt 60 Minuten nach der Injektion der KX-Anästhesie. c Messungen an N = 4 (Mittelwert ± SD) Mäusen zeigen eine signifikante Verdickung im Zusammenhang mit der KX-Injektion (zweiseitiger Student-T-Test). d Die Auswertung der TRT-Änderungen im Vergleich zu drei Exzentrizitätsbereichen auf der Netzhaut zeigt keinen signifikanten Unterschied (schwarze Liniendarstellung, Mittelwert ± SD, N = 4 Mäuse). En-face-Karten der TRT-Änderung zeigen auch keine erkennbaren lokalen Unterschiede in Bezug auf Regionen oder Strukturen auf der Netzhaut.

Die kopfgestützte Mauspräparation ermöglicht eine stabile optische Achse, durch die zelluläre Struktur- und Funktionsmessungen des wachen Mausauges mit standardmäßigen und hochauflösenden ophthalmologischen Bildgebungsmodalitäten abgebildet werden können. Die Schaffung dieser stabilen Augenbildachse ermöglicht weiterhin eine freie Bewegung der Maus, was den Stress in der Eingrenzung reduziert und darüber hinaus ein Tor für Verhaltensstudien und die visuelle Interaktion der Maus mit Umgebungen mit oder ohne Anästhesie bietet. Dies ermöglicht einen neuen Bereich der Netzhautforschung an der Maus, der den Einfluss der Anästhesie auf die Netzhautbildgebung untersuchen und/oder korrigieren kann, da viele Studien diesen Einfluss auf den Kortex untersucht haben5. Um einen Aspekt der Wirkung der Anästhesie zu demonstrieren, haben wir zum ersten Mal Blutflussmessungen sowohl im Wachzustand als auch im Anästhesiezustand bei denselben Mäusen charakterisiert und verglichen. Durch die Messung des retinalen Blutflusses (RBF) zeigen wir, dass der Blutfluss durch die KX-Anästhesie unterdrückt wird. Dies bestätigt Beweise aus früheren Studien9,37, liefert nun aber eine Auflösung im Mikrometerbereich, die für genaue Messungen des Blutflusses in Gefäßen, die bei der Maus weitaus kleiner als 3–45 Mikrometer sind, von entscheidender Bedeutung ist15. Diese Arbeit ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Grundlagen der neurovaskulären Kopplung und der Regulierung des mikrovaskulären Flusses in Krankheitsmodellen, die am besten ohne den Einfluss einer Anästhesie untersucht werden können, die die Dynamik und den Ausgangszustand beeinträchtigen oder abschwächen könnte. Wir stellen außerdem fest, dass die KX-Anästhesie laut OCT eine deutliche Verdickung der Netzhaut hervorruft. Nach unserem Kenntnisstand wurde über eine solche fortschreitende Verdickung nicht berichtet, und die Mechanismen sind unklar. Auch wenn dies spekulativ ist, gehen wir davon aus, dass die beobachtete Veränderung der Netzhautdicke und des RBF durch Veränderungen des Augeninnendrucks38 beeinflusst werden könnte, der durch KX-Anästhesie moduliert werden kann39. Es wurde auch festgestellt, dass eine KX-Anästhesie eine Depression der Atem- und Herzfrequenz sowie einen Abfall des mittleren Arteriolendrucks hervorruft, was zu einer Veränderung des RBF40 führen könnte. Während weitere Untersuchungen erforderlich sind, um die Natur solcher Veränderungen zu ermitteln, unterstreicht dieser Befund die Bedeutung der Durchführung solcher Messungen im Wachzustand, da die Anästhesie die Interpretation von In-vivo-Mausmessungen von Krankheiten verzerren kann, insbesondere da sie herkömmliche Interpretationen der Netzhaut verfälschen kann Zellverlust/-überleben.

Es ist zu bedenken, dass In-vivo-Studien zur Bildgebung der Netzhaut zwar darauf abzielten, Augenbewegungen zu entfernen, um eine stabile Bildgebungsplattform zu schaffen, dies jedoch auch zur Folge hat, dass natürliche Eingaben in das Auge entfernt werden. Hier erkennen wir an, dass die Beibehaltung der natürlichen Augenbewegung eine Chance bietet, besser zu verstehen, wie die Augenbewegung und das visuelle System zusammenarbeiten, um dem Organismus Sehkraft zu verleihen41. Um ein solches Beispiel zu demonstrieren, zeigen wir die aktive Bildgebung während des freien Blickverhaltens der wachen Maus. Wie beim Menschen gibt es eine temporal-nasale Präferenz, wenn die Maus den visuellen Horizont abtastet21. Wir stellen auch fest, dass Mäuse bevorzugte Blickpositionen haben (Abb. 3), obwohl ihnen die Fixierungsfähigkeit fehlt, die normalerweise foveierten Säugetieren zugeschrieben wird21. In einem feineren Maßstab, der durch die hohe räumlich-zeitliche Auflösung AOSLO ermöglicht wird, zeigen wir eine hochfrequente Augenbewegung mit niedriger Amplitude und einer zeitlichen Frequenz, die dem menschlichen Augenmikrotremor (OMT) ähnelt. Provokativerweise entspricht die Amplitude der schnellen Augenbewegung bei beiden Arten etwa der Hälfte der maximalen gemeldeten Sehschärfe30. In weiteren Studien wird es interessant sein zu sehen, ob diese Augenbewegung ein konserviertes Merkmal des Sehvermögens von Säugetieren sein könnte, das mit der Größe des Empfangsfeldes oder der Sehschärfe skaliert. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht über diese hochfrequente Bewegung mit niedriger Amplitude bei der Maus (Abb. 6). Die Einbeziehung dieses dynamischen visuellen Inputs der Netzhaut könnte bemerkenswerte Konsequenzen für die räumlich-zeitliche Charakterisierung visueller Empfangsfelder in der Maus haben, die sich über die Netzhaut bis zum Kortex erstrecken42,43,44. Wir zeigen, dass eine solche Augenbewegung über den gesamten zirkadianen Tag-/Nachtzyklus hinweg 10 Stunden lang aufrechterhalten wird (Abb. 7). Wichtig ist, dass diese hochfrequenten Augenbewegungen durch die Anästhesie eliminiert werden, was für die hochauflösende Bildgebung von Vorteil ist (Bewegungsunschärfe wird vermieden); Allerdings werden diese Informationen auch als natürliche Eingabe für videobasierte oder statische visuelle Reize entfernt. Weitere Untersuchungen könnten eine häufige Anforderung des Sehvermögens von Säugetieren aufdecken, gezielte Augenbewegungen auf dieser mikroskopischen Skala zu integrieren, um den räumlich-zeitlichen Kontrast für das visuelle System zu verbessern30,41. Im Einklang mit diesem Interesse hat der Einfluss des Gangs in einigen Studien auf eine offensichtliche Steigerung der Sehschärfe und Reaktionsverstärkung bestimmter visueller Neuronen hingewiesen, die mit der Fortbewegung bei der Maus verbunden sind,45 die nun auf Netzhautebene untersucht werden können. Wir gehen auch davon aus, dass die Messungen solch hochfrequenter Augenbewegungen mit niedriger Amplitude einen neuen, nützlichen Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen in zahlreichen Mausmodellen liefern könnten, die darauf abzielen, die Integrität neuronaler Schaltkreise zu quantifizieren, die für die Augenbewegungssteuerung verantwortlich sind46. Abschließend ist anzumerken, dass über die Untersuchung solcher Augenbewegungen hinaus beim Bemühen, die neuronale Funktion und Kontrolle zu verstehen, die Berücksichtigung und Korrektur von Augenbewegungen von entscheidender Bedeutung ist, um hochauflösende Bilder der Netzhaut zu erhalten. Ohne Korrektur kommt es bei hochauflösenden Bildgebungsmodalitäten mit Belichtungszeiten von mehr als ~5 ms (Bildfrequenz 200 Hz) zu Bewegungsunschärfe. Und obwohl Blitzlichtaufnahmen solche Unschärfen mildern könnten, gibt es bisher nur wenige Ophthalmoskope mit Videoerfassung, die diese Bildgeschwindigkeiten erreichen, insbesondere für die Maus. Dies würde bedeuten, dass selbst bei perfekter Optik das Netzhautbild im Wachzustand in einer Größenordnung von 10–20 Mikrometern unscharf wäre. Daher muss die hochauflösende Bildgebung sowohl eine Aberrationskorrektur als auch eine Hochgeschwindigkeitsbildgebung/Registrierung von >200 Hz erreichen, um ein beugungsbegrenztes Potenzial bei der wachen Maus zu erreichen.

Der Verzicht auf eine Anästhesie hat auch einen großen Vorteil bei der Untersuchung der In-vivo-Physiologie über längere Zeitintervalle. Bisherige Studien an Mäusen konzentrierten sich auf die Bildgebung der Netzhaut unter Narkose, die größtenteils auf 30–120 Minuten beschränkt war. Dies ist auf eine Anästhesieunverträglichkeit (schlechtes Überleben der Tiere) oder eine vorübergehende Kataraktbildung bei Bildgebung über längere Zeiträume zurückzuführen. Hier zeigen wir, dass es möglich ist, ein halbkontinuierliches Bildgebungsprotokoll durchzuführen, das die Bildgebung desselben Tieres über 10 Stunden oder länger ermöglicht. Vollständig kontinuierliche Aufzeichnungen sind möglich, wenn die richtigen wissenschaftlichen Fragestellungen dies erfordern. Es wird jedoch empfohlen, den Tieren Pausen in ihrem Käfig zu gönnen, in denen sie sich erholen, fressen, sich ausruhen und schlafen können. Dieses Paradigma öffnet ein enormes zeitliches Fenster, um physiologische Herausforderungen auf der Skala von Stunden, wenn nicht Tagen, genau zu untersuchen. Beispielsweise können zirkadiane Veränderungen, das Ansprechen auf eine medikamentöse Therapie, die Bewegung von Immunzellen36, die systemische glykämische Modulation und Trainingsprogramme47 nun über den Verlauf von Sekunden bis Stunden in einer einzigen Sitzung und halbkontinuierlich über Tage hinweg untersucht werden, ohne dass es zu einer akkumulierten Narkosetoxizität kommt oder Komplikationen von Frontzahntrübungen, die herkömmlicherweise eine solche Studie, die eine Anästhesie erfordert, eingeschränkt haben.

Die Labormaus gehört zu den beliebtesten Modellen zur Darstellung von Aspekten menschlicher Krankheiten. Hier rücken wir das Modell einen weiteren Schritt näher, um die normale Physiologie des Säugetierauges zu erfassen, indem die Notwendigkeit einer Anästhesie entfällt. Um diesen Ansatz weltweit verfügbar zu machen, wird eine kostengünstige 3D-druckbare Lösung bereitgestellt, die in jedem Labor reproduziert werden kann, das Zugang zu einem 3D-Drucker und Zugang zu Teilen auf dem freien Markt hat. Dieses Design soll einen Proof-of-Concept liefern und stabile Augenmessungen bei der Maus ohne Anästhesie demokratisieren. Es gibt unzählige Anwendungen, die auf dieser Arbeit aufbauen können und das Potenzial haben, unser Verständnis der Grundlagen des Sehens, des Verhaltens, der neuronalen Struktur, der funktionellen Integrität und der grundlegenden Physiologie des Maussehens zu verbessern. Wir gehen davon aus, dass einige der frühesten Anwendungen den Einfluss der Anästhesie auf eine Reihe grundlegender physiologischer Funktionen untersuchen werden. Andere nutzen möglicherweise die Auflösung und die Netzhautverfolgungsfunktionen, um schnelle und mikroskopische Augenpositionsaufzeichnungen in frei sichtbaren oder simulierten visuellen Umgebungen zu verbessern. Wir behaupten, dass Vergleiche der visuellen Physiologie zwischen Maus und Mensch jetzt noch genauer sind, da keine Anästhesie erforderlich ist, die in der klinischen ophthalmologischen Bildgebung selten verwendet wird. Schließlich wird der Wert einer Langzeitbewertung, die sich über Stunden bis Tage erstreckt, ein neues Regime der Untersuchung der Physiologie und Struktur über ein neues Zeitfenster hinweg ermöglichen, das für das Ansprechen auf die Therapie, den zirkadianen Zyklus und allmählichere Veränderungen von entscheidender Bedeutung ist würde andernfalls aufgrund der logistischen Herausforderungen der begrenzten Bildgebungsfenster, die durch die Anästhesie eingeschränkt sind, übersehen werden. Insgesamt gehen wir davon aus, dass dies den Beginn spannender neuer Studien zu Nerven- und Verhaltensstudien an der Maus darstellen wird, einem der mächtigsten Partner in der biomedizinischen Forschung.

Der Kopf der Maus wurde durch eine Klammer festgehalten, die einen seitlich positionierten Arm ihrer chirurgisch implantierten Y-förmigen Kopfplatte hielt. Die Kopfplatte wurde vertikal über einem Laufrad (90 mm Durchmesser) positioniert, sodass sich die Maus während der Bildgebung frei und in natürlicher Haltung und Gangart bewegen kann. Durch die seitliche Positionierung der Klemme ist auch eine Bildgebung des kontralateralen Auges möglich. Die Klemme bestand aus zwei ineinandergreifenden Teilen, die 3D-gedruckt wurden, um einen festen Sitz um die Kopfplatte herum zu schaffen und eine stabile Kopfstütze zu gewährleisten, obwohl sie nur auf einer Seite gehalten wird. Alle Komponenten der Radplattform, mit Ausnahme des Lagers und der Achse, wurden mit Polymilchsäuren 3D-gedruckt (Ultimaker, Ultimaker BV, Utrecht, Niederlande). An der Radachse wurde ein Drehgeber (ENS1J-B28 L00256L, Bourns, Inc, Riverside, CA, USA) angebracht, der eine synchrone Drehung ermöglichte. Der Encoderausgang wurde von einer Datenerfassungskarte (USB-6001, National Instruments, Austin, TX, USA) erfasst. Der Gangabstand und die Geschwindigkeit wurden mit MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc., Massachusetts, USA) aus den Encoder-Ausgangssignalen extrahiert. Die Fortbewegungsdaten wurden offline basierend auf den Zeitstempeln der gleichzeitig erfassten Bilddaten synchronisiert. Die 3D-Druckdateien und detaillierten Montageanleitungen sind öffentlich zugänglich unter „https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.git“.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt und vom University Committee on Animal Resources der University of Rochester genehmigt. C57BL/6J-Mäuse wurden von The Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) gekauft. Für die Experimente wurden zwölf Mäuse im Alter von 6–10 Monaten verwendet. Alle Tiere wurden in der Labortieranlage Vivarium des University of Rochester Medical Center in einem 12- und 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus mit Futter und Wasser nach Belieben gehalten.

Das Zeitprotokoll der Kopfplattenimplantation und des Tiertrainings ist in Abb. S1 dargestellt. 24 Stunden vor der Operation wurde eine subkutane Buprenorphin-Injektion (0,5–1 mg/kg) verabreicht. Am Tag der Operation wurden die Mäuse gewogen, betäubt, in einen stereotaktischen Kleintierrahmen (Modell der Serie 900, David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) überführt und mit den Ohrbügeln und dem Schneidezahnbügel für einen flachen Schädel gesichert. Die Rückseite des Kopfes wurde zuerst rasiert und die Haut dann mit einem 70-prozentigen Isopropylalkohol-Vorbereitungspad (Katalognummer: MDS090735, Medline, Northfield, IL, USA) gereinigt. Von der Schädelbasis bis zum Stirnbein zwischen den Augen wurde ein etwa 2–3 cm langer Mittellinienschnitt vorgenommen. Dann wurden seitliche Einschnitte an der Stelle vorgenommen, an der der Schläfenmuskel in den Schädel eindringt. Die darüber liegende Faszie wurde durch stumpfe Dissektion und häufige Spülung vorsichtig entfernt, um die Schädeloberfläche freizulegen. Anschließend wurde eine Y-förmige 3D-gedruckte Kopfplatte durch Auftragen einer Mischung aus Zahnzement (Jet XR Shadow Powder, Lang Dental, Wheeling, IL, USA) und Cyanacrylatkleber (Verhältnis 2:1) (Krazy Glue Maximum Bond) fest am Schädel gehalten , Krazy Glue, USA). Die Kopfplatte sollte über dem Schnittpunkt von Koronarnaht und Bregma zentriert sein, wobei ein medialer Arm mit der Mittellinie zum Nasenbein ausgerichtet sein sollte. Die Mäuse wurden in einem Einzelgehäuse mit Papphäusern untergebracht, um sich nach der Operation drei Tage lang zu erholen. Insgesamt wurde die Gesundheit der Mäuse jeden Tag durch visuelle Beobachtung des Aussehens des Haarkleides und des Aktivitätsniveaus überwacht. Nach der Genesung wurden mindestens fünf Trainingseinheiten von 30–60 Minuten durchgeführt, um die Mäuse an die kopfgestützte Bildgebungsplattform zu gewöhnen. Das Gewicht der Maus wurde bei jeder Trainingseinheit überwacht. In den ersten beiden Sitzungen wurden die Mäuse mit einer Ketamin-Xylazin-Mischung (100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin) leicht anästhesiert und dann mit auf der Plattform gefesseltem Kopf erholt, um eine Eingewöhnung zu ermöglichen. Nach der Genesung konnte die Maus 30–45 Minuten lang laufen. Diese beiden Trainingseinheiten wurden im Abstand von 24 Stunden durchgeführt, um eine aufeinanderfolgende Anästhesieanwendung zu vermeiden. Es wurden drei oder mehr aufeinanderfolgende 45-minütige Trainingseinheiten ohne Anästhesie durchgeführt, sodass sich die Mäuse im völlig wachen Zustand an den Kopfstützenzustand gewöhnen konnten. Mäuse, die einen stabilen Gang und eine stabile Haltung sowie entspannte Verhaltensmerkmale wie Fellpflege aufweisen, gelten als akklimatisiert und bereit für die Bildgebung.

Bei der Bildgebung mit der wachen Maus wurden außer der Pupillenerweiterung keine weiteren Eingriffe am Auge durchgeführt. Die Pupillenerweiterung wurde entweder bei wachen oder anästhesierten Mäusen durchgeführt, was durch die Gabe von Augentropfen mit 1 % Tropicamid (Sandoz, Basel, Schweiz) und 2,5 % Phenylephrin (Akorn, Lake Forest, Illinois, USA) erreicht wurde. Die Bildgebung wurde in einer dunklen Umgebung mit einer 10–15-minütigen Dunkeladaptationsphase vor Beginn jeder Bildgebungssitzung durchgeführt. Da die Einstellung der Rollrotationsachse mit der Maus auf unserer Plattform begrenzt war, lag das Sichtfeld der AOSLO-Bildgebung größtenteils im oberen Quadranten der Netzhaut. Bei der Bildgebung mit anästhesierten Mäusen wurde eine intraperitoneale Injektion einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg-Dosis) und Xylazin (10 mg/kg-Dosis) angewendet. Ein externes Heizkissen und ein rektales Sondenthermometer (Physiosuite, Kent) wurden verwendet, um die Körpertemperatur der anästhesierten Mäuse zu überwachen und auf 37,0 °C aufrechtzuerhalten. Um eine Augentrübung durch Dehydrierung unter Narkose zu verhindern, wurde eine Kontaktlinse (Advanced Vision Technologies, Lakewood, Colorado, USA) über das abzubildende Auge gelegt und eine künstliche Träne (GenTeal, Alcon Laboratories, Inc, Fort Worth, Texas, USA) angebracht ) wurde während der Bildgebung routinemäßig alle 20 Minuten angewendet.

SLO- und OCT-Bildgebung wurden mit einer kommerziellen multimodalen Netzhautbildgebungsplattform (HRA Spectralis, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden sowohl OCT- als auch SLO-Bilder mit dem 30°-FOV-Objektiv aufgenommen. Die Pixelauflösung von SLO betrug 1536 × 1536, während die OCT-Würfel 1536 × 596 × 97 Voxel hatten. Das En-Face-FOV des OCT-Würfels betrug 20° × 20° und wurde mit der integrierten ART-Funktion (Automated-Retinal-Tracking) registriert. Jeder OCT-Schnitt wurde außerdem über 40 Bilder gemittelt, um das SNR zu verbessern.

Das Mehrkanal-AOSLO wurde in der vorherigen Literatur14 beschrieben. Es ermöglicht die Netzhautbildgebung mit Modalitäten wie konfokaler Reflexions-, Phasenkontrast- und Fluoreszenzbildgebung. Konfokale Reflexion und Phasenkontrastbildgebung wurden mit einer 796-nm-Superlumineszenzlaserdiode mit 17 nm Bandbreite (200–500 µW an der Hornhaut, S790-GI-15, Superlum, Irland) und einer 488-nm-Laserdiode (220–330 µW) durchgeführt µW an der Hornhaut (iChrome MLE, Toptica Photonics, Farmington, NY, USA) wurde als Anregungsquelle für die Fluoreszenzbildgebung verwendet. Eine 2,1-ADD-Lochblende wurde in der Bildebene des NIR-Kanals für die konfokale Reflexions- und Phasenkontrastbildgebung verwendet. Um eine Phasenkontrastbildgebung zu ermöglichen, wurde die Lochblende um ca. 22 ADD seitlich versetzt (Guevara, 2020). Ein Hartmann-Shack-Wellenfrontsensor (HSWS) wurde eingesetzt, um die Wellenfront des Mausauges in Echtzeit zu messen. In Kombination mit dem verformbaren Spiegel (DM97-1, ALPAO, Montbonnot-Saint-Martin, Frankreich) wurde die inhärente Aberration im Mausauge im Close-Loop korrigiert.

Durch Fokussierung auf die Augenlider und den Augenwinkel wurde die Austrittspupille des Mausauges mittels NIR SLO in einer Geschwindigkeit von 8,8 fps mit 768 × 768 Pixeln abgebildet. Die Bildgebung wurde an fünf gesunden Kopfplattenmäusen im Wachzustand durchgeführt. Jede Bildgebungssitzung dauerte etwa 20 Minuten und es wurden 17 Videos mit der vom System maximal zulässigen Länge (59,88 s) aufgezeichnet, wobei die Lücken je nach Datenpufferungszeit zwischen zwei Aufnahmen zwischen 5 und 30 s variierten. Ein spezieller, in Matlab geschriebener Pupillenverfolgungsalgorithmus wurde verwendet, um die Pupillenregion automatisch aus dem SLO-Video zu verfolgen. Es wurde eine texturbasierte Segmentierungsstrategie verwendet (Abb. S2). Zunächst wurde ein Standardabweichungsfilter (STD) auf das Bild angewendet, um den Pupillenbereich hervorzuheben, während die Pupille im Vergleich zu den umgebenden Geweben wie Augenlid und Fell eine geringere räumliche Varianz aufweist. Die räumliche STD-Karte wurde dann mit Schwellenwertbildung binarisiert (STD <0,25) und die Pupillenregion wurde mit einem Wassereinzugsgebietsalgorithmus segmentiert. Die Kontur des Pupillenbereichs wurde schließlich mit einer elliptischen Funktion versehen. Es wurden Logikgatter eingestellt, um Fehlalarme mit ungewöhnlich großen und schnellen Änderungen der erkannten Pupillengröße und -position zu verhindern. Die Pupillenanpassungsleistung wurde als Überlappungsfläche zwischen der segmentierten Austrittspupille des Mausauges und einer statischen virtuellen kreisförmigen Eintrittspupille an der mittleren Position aller Datenpunkte quantifiziert. Bei der Analyse der Korrelation mit der Fortbewegung der Maus wurden die Pupillenanpassungsdaten über Zeitintervalle von 1 Sekunde gemittelt, um die gleichzeitig aufgezeichneten Fortbewegungsdaten abzugleichen.

Die Versuchsprotokolle für die Blinzel- und Blickverschiebungsmessung waren identisch mit der Pupillenmessung. Der einzige Unterschied bestand darin, dass der SLO auf die Nervenfaserschicht in der Netzhaut fokussiert war. Hier wurde das Blinkereignis anhand der mittleren Bildintensität der Frames erkannt. Es wurde davon ausgegangen, dass bei einem Frame ein Blinkereignis auftritt, wenn seine Bildintensität unter 60 % der durchschnittlichen Bildintensität des gesamten Videos liegt (Abb. S3). Wir haben einen in Matlab geschriebenen halbautomatischen Netzhautverfolgungsalgorithmus implementiert, um globale Offsets für das SLO-Netzhautbild zu quantifizieren. Drei verschiedene Referenzvorlagen mit klar definierten Merkmalen, wie z. B. der Papille und den Blutgefäßverbindungen, wurden zunächst manuell aus einem Referenzbild ausgewählt (Abb. S4a). Die Größe und Position der Vorlagen wurden von erfahrenen Benutzern über eine geführte Benutzeroberfläche bestimmt. Die drei Vorlagen wurden als Referenz verwendet, um eine 2D-Kreuzkorrelation mit jedem Netzhautbildrahmen durchzuführen (Abb. S4b). Der Netzhautversatz wurde durch einen der drei aus der 2D-Kreuzkorrelation extrahierten relativen Versätze bestimmt, der den größten normalisierten Korrelationskoeffizienten (NCC) aufweist (Abb. S4c). Logit-Gates wurden implementiert, um Datumspunkte zu entfernen, wenn Blinks auftreten.

Ein zuvor beschriebener benutzerdefinierter streifenbasierter Registrierungsalgorithmus wurde verwendet, um die Bewegungsverzerrung für AOSLO-Bilder zu korrigieren26. Kurz gesagt wurde das Bild entlang der langsamen Scanachse in Streifen aufgeteilt und jeder Streifen wurde einzeln mit 2D-Kreuzkorrelation mit dem Referenzbild registriert, um den durch die schnellen Augenbewegungen verursachten Schereffekt zu korrigieren. Hier betrug die Breite des ausgewählten Streifens 32 Zeilen (entspricht einer Abtastrate von 468 Hz), was leicht über der Nyquist-Rate der oberen Bandbreite der hochfrequenten Augenbewegungen (~200 Hz) liegt. Registrierte Streifen mit einem NCC kleiner als 0,5 wurden als „Fehlerregistrierung“ betrachtet und aus dem registrierten Bild entfernt. Um das Fluoreszenzbild zu registrieren, wurden alle Bilder vor der Registrierung mit einem 2D-Gaußschen Kernel mit \(\sigma =5\) Pixeln gefaltet, um die 2D-Kreuzkorrelationsleistung für schwache Photonenzahlen zu verbessern.

Die hochfrequente Augenbewegung mit niedriger Amplitude wurde mit AOSLO gemessen, indem ein 1D-Bildgebungsstrahl mit 15 kHz über ein großes Blutgefäß der Netzhaut gescannt wurde. Wenn die Augenbewegung vorhanden ist, wird das abgebildete raumzeitliche Profil des Blutgefäßes geschert (Abb. S5a rechts). Die Amplitude der Augenbewegungskomponente orthogonal zum Blutgefäß \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|\) kann extrahiert werden als: \(\left|{{{{{{\boldsymbol{w}}}}}}}_{{{{{{\boldsymbol{1}}}}} }}\right|=\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|{{\sin }}(\theta )\), wobei \(\theta\) der Winkel ist zwischen dem Blutgefäß und der Scanachse und \(\left|{{{{{\bf{v}}}}}}\right|\) ist die Scherung des raumzeitlichen Blutgefäßprofils (Abb. S5a links). ). Zur Extraktion der Scherspur wurde ein vollautomatischer Algorithmus verwendet, der dem Streifenregistrierungsalgorithmus zur Bewegungskorrektur ähnelt, jedoch nur eine 1D-Kreuzkorrelation entlang der Raumrichtung durchführt. Zwanzig Referenzstreifen mit einer Breite von 32 Scanlinien wurden zunächst zufällig aus dem raumzeitlichen Bild ausgewählt (Abb. S5b). Mit jedem Referenzstreifen wurde entlang der Raumachse eine 1D-Kreuzkorrelation durchgeführt, um 20 Kandidatenspuren zu erzeugen, die dann durch Normalisierung auf die Mittelwerte ausgerichtet wurden. Versetzte Datenpunkte in den Kandidatenspuren weisen im Vergleich zum vorherigen Zeitpunkt Änderungen von mehr als 10 Pixeln auf, wurden als falsch positive Ergebnisse behandelt und von der zukünftigen Analyse ausgeschlossen. Schließlich wurden die 20 Kandidatenspuren Punkt für Punkt zur endgültigen Ausgabebewegungsspur zusammengeführt, indem der Medianwert berechnet wurde (Abb. S5c). Die extrahierten Bewegungsspuren wurden durch eine visuelle Untersuchung validiert, die von einem erfahrenen Benutzer durch Untersuchung der registrierten Raum-Zeit-Bilder durchgeführt wurde (Abb. S5d). Messungen mit schlecht registrierten Bildern wurden als „nicht bestanden“ gewertet und aus der Analyse entfernt.

Der Einzelzellblutfluss wurde bei wachen Mäusen nichtinvasiv gemessen, wobei ein Ansatz zum Einsatz kam, der ausführlich in unserer vorherigen Veröffentlichung beschrieben wurde15. Kurz gesagt, Blutgefäße wurden durch Einfrieren des langsamen (Galvo-)Scanners schräg in 1D (15 kHz) gescannt und aufeinanderfolgende Scans wurden zeitlich verkettet, um ein Raum-Zeit-Bild zu erzeugen (Abb. S6a). Blutzellen erscheinen als diagonale Streifen, die ihre Position im Scan anzeigen. Die Neigung des Streifens in Kombination mit dem Winkel zwischen der Flussrichtung und der Position des 1D-Scans (extrahiert aus dem anschließend erfassten 2D-Rasterbild) wurde in einem automatisierten Algorithmus verwendet, der die Radon-Transformation nutzte, um die Blutzellengeschwindigkeit zu extrahieren. In unseren Raum-Zeit-Bildern stellen Streifen, die sich einer vertikalen Ausrichtung nähern, Zellen mit höherer Geschwindigkeit dar. Der Radon-Algorithmus funktioniert, indem er Raum-Zeit-Bilder in überlappende ROIs aufteilt. Jeder ROI wird iterativ um 180° gedreht und für jede Iteration wird eine 1D-Intensitätsprojektion extrahiert. Die Standardabweichung wurde für jede 1D-Projektion berechnet und der höchste Wert gab den dominanten Winkel an und ergab somit eine Geschwindigkeit für den ROI. Die Messbandbreite dieser Technik betrug 0,03–1275 mm/s, was mehr als ausreichend war, um biologisch mögliche Blutzellgeschwindigkeiten in der Netzhaut einer wachen Maus zu messen. Der pulsierende Fluss wurde mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung gemessen und als Geschwindigkeitsfarbkarte dem Raum-Zeit-Bild überlagert (Abb. S6b). Um den Gefäßlumendurchmesser zu bestimmen, wurden Bewegungskontrastbilder des Blutgefäßes aus kartesischen 2D-Bildern erstellt. Die Abbildung von Vorwärts- und Mehrfachstreulicht durch die RBC-Säule in Mikrogefäßen mit einer Größe von <50 µm trug dazu bei, eine genaue Messung des Lumendurchmessers zu erhalten. Zusammengenommen ergaben die Geschwindigkeits- und Durchmessermessungen die mittlere Durchflussrate (in µL/min) durch jedes Gefäß. Diese Messungen wurden gleichzeitig mit den im obigen Abschnitt beschriebenen Messungen der Augenbewegungen durchgeführt. Die Strömungsdurchmesser-Modellkurven wurden an die gemessenen Daten im Vergleich zu den beiden Populationen angepasst. Kurz gesagt hatte das verwendete Modell die Form y = axb. Dabei ist y die Durchflussrate (µL/min) und x der Durchmesser (µm).

Die Messung der Netzhautdicke wurde mit HRA OCT durchgeführt. Der „Follow-up“-Modus wurde verwendet, um eine Längsbildgebung an derselben Stelle in der Netzhaut durchzuführen, wobei der erste Zeitpunkt als Referenz diente. Die gesamte Netzhautdicke (TRT) wurde als Abstand zwischen der Grenze zwischen Glaskörper und innerer Grenzmembran (Glaskörper-ILM) und der Grenze zwischen äußerem Segment und retinalem Pigmentepithel (OS-RPE) definiert (Abb. S7a, b). Bei der Analyse wurde ein kreisförmiger Bereich mit einem visuellen Grad von 8° ausgeblendet, dessen Mittelpunkt die Sehnervenpapille ist und der schwer zu segmentieren ist (Abb. S7c). Die Schichten wurden durch einen benutzerdefinierten Segmentierungsalgorithmus mit graphischer Theorie und dynamischer Programmierung erkannt, der auf der zuvor von Ref. berichteten Strategie basiert. 48.

Alle Daten in der aktuellen Studie stammten von 12 Mäusen auf dem C57BL/6 J-Hintergrund aus Jackson Labs (Bar Harbor, ME) Stamm (CX3Cr1, thy-1 YFP, B6 Stamm). Die Mäuse wurden entweder direkt aus den Jackson-Laboren oder als Nachkommen einiger Koloniegenerationen der ursprünglichen Gründermäuse abgebildet. Alle Messungen in der Studie wurden entweder mehrmals an derselben Maus (z. B. Abb. 2–4, 6–9) oder zum Vergleich an mehreren Mäusen durchgeführt. Beim Vergleich zwischen zwei verschiedenen Zeitpunkten oder Gruppen wurden die Unterschiede anhand eines einfachen gepaarten T-Tests zum Vergleich der Bedingungen bewertet. Statistische Tests wurden in Matlab® durchgeführt und mit einem Signifikanzschwellenwert von p-Werten *p < 0,1, **p < 0,05 angegeben. Es werden tatsächliche p-Werte angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Quelldaten hinter den Abbildungen sind in den Dateien „Supplementary Data 1–7“ enthalten. Verarbeitete SLO-Daten und rohe AOSLO- und OCT-Videos sind in einem öffentlichen Repository (Zenodo) verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.7806898. Weitere Daten sind auf begründete Anfrage bei den Autoren erhältlich.

3D-Druckdateien des kopfgestützten Maus-Setups und alle Codes für die Datenverarbeitung sind im öffentlichen Repository (GitHub) verfügbar: https://github.com/GP-Feng/Awake_Mouse_Imaging_CommBio.

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Das Schallek-Labor wird vom National Eye Institute der National Institutes of Health unter R01 EY028293 und P30 EY001319 unterstützt. Padmanabhan wird durch Zuschüsse der National Institutes of Health R01 MH113924, P50 HD103536 und der National Science Foundation (NSF) CAREER 1749772 unterstützt. Die Forschung wurde auch durch ein uneingeschränktes Stipendium an die Abteilung für Augenheilkunde der University of Rochester, einen Career Development Award, ein Career Advancement Award und ein Stein Award von Research to Prevent Blindness (RPB), New York, New York; den David Mahoney Neuroimaging Award der Dana Foundation und ein Forschungsstipendium von Genentech Inc. (Schallek).

Abteilung für Biomedizintechnik, University of Rochester, Rochester, NY, 14620, USA

Guanping Feng & Kosha Dholakia

Zentrum für visuelle Wissenschaft, Universität Rochester, Rochester, NY, 14627, USA

Guanping Feng, Aby Joseph, Kosha Dholakia, Fei Shang, Charles W. Pfeifer, Derek Power, Krishnan Padmanabhan und Jesse Schallek

Das Institut für Optik, Universität Rochester, Rochester, NY, 14620, USA

Damit Joseph

Abteilung für Neurowissenschaften, University of Rochester, Rochester, NY, 14642, USA

Fei Shang, Krishnan Padmanabhan und Jesse Schallek

Flaum Eye Institute, University of Rochester, Rochester, NY, 14642, USA

Charles W. Pfeifer & Jesse Schallek

Forschungszentrum für geistige und entwicklungsbedingte Behinderungen, Universität Rochester, Rochester, NY, 14642, USA

Krishnan Padmanabhan

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JS hat diese Studie konzipiert. KP lieferte die Idee und das Design für die Vorbereitung und Einrichtung der kopfgestützten Maus. GF, AJ, KD, FS, CWP, DP und JS haben Experimente entworfen und durchgeführt. GF, AJ und FS analysierten und interpretierten die Daten. GF, AJ, KD, FS, DP und JS haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript Korrektur gelesen und bearbeitet.

Korrespondenz mit Jesse Schallek.

Das Labor wurde teilweise durch ein gemeinsames Forschungsstipendium von Genentech Inc. unterstützt. Jesse Schallek hält US-Patente auf ophthalmologische Bildgebungstechnologie, die von der University of Rochester gehalten werden. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt Thomas J. Gast und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Joao Valente. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Feng, G., Joseph, A., Dholakia, K. et al. Hochauflösende strukturelle und funktionelle Netzhautbildgebung bei der wachen Maus. Commun Biol 6, 572 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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Eingegangen: 18. Mai 2022

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04896-x

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