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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 217 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Gewebemechanik bestimmt die Gewebehomöostase, die Krankheitsentwicklung und das Fortschreiten. Die Blase ist in hohem Maße auf ihre mechanischen Eigenschaften angewiesen, um ihre physiologische Funktion zu erfüllen, diese sind jedoch unter normalen und pathologischen Bedingungen nur unzureichend sichtbar. Hier charakterisieren wir die mechanischen Fingerabdrücke auf Mikroebene der drei Gewebeschichten, aus denen die gesunde Blasenwand besteht, und identifizieren Veränderungen, die mit dem Auftreten und Fortschreiten pathologischer Zustände (z. B. aktinische Zystitis und Blasenkrebs) verbunden sind. Wir verwenden zwei eindruckbasierte Instrumente (ein Rasterkraftmikroskop und einen Nanoindenter) und vergleichen die mikromechanischen Karten mit einer umfassenden histologischen Analyse. Wir stellen fest, dass die gesunde Blasenwand ein mechanisch inhomogenes Gewebe mit einem Gradienten zunehmender Steifheit vom Urothel zur Lamina propria ist, der beim Erreichen der äußeren Muskelschicht allmählich abnimmt. Die Versteifung fibrotischer Gewebe korreliert mit einer erhöhten Ablagerung dichter extrazellulärer Matrix in der Lamina propria. Vor dem Auftreten und der Invasion des Tumors wird eine Erhöhung der Gewebecompliance beobachtet. Durch die Bereitstellung einer hochauflösenden mikromechanischen Untersuchung jeder Gewebeschicht der Blase stellen wir die intrinsische mechanische Heterogenität der Schichten einer gesunden Blase im Vergleich zu den Veränderungen der mechanischen Eigenschaften dar, die entweder mit aktinischer Zystitis oder Blasentumor einhergehen.

Elastizität und Viskosität charakterisieren die mechanischen Eigenschaften von Weichgeweben und spielen eine entscheidende Rolle bei der Definition von Zell- und Gewebefunktionen sowie bei der Gewebeentwicklung, dem Krankheitsverlauf und der Gewebehomöostase1,2,3. Jedes spezifische Organ verfügt über besondere mechanische Eigenschaften, die sich verändern, wenn die Homöostase gestört ist und sich Krankheiten entwickeln, wie dies bei Alterungsprozessen, Krebs, Fibrose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes der Fall ist4,5,6,7,8.

Die Blase ist ein Hohlorgan, das sich beim Füllen und Entleeren anpassen und dehnen muss. Seine Funktionen werden durch Zyklen mechanischer Entspannung und Kontraktilität erreicht. Die mechanischen Eigenschaften der Blase wurden auf Makroebene berichtet9,10, einschließlich der Charakterisierung der verschiedenen makroskopischen Bereiche11. Eine Veränderung der mechanischen Eigenschaften der Blase führt zu einer Funktionsstörung ihrer physiologischen Rolle, wie es bei vielen gutartigen Blasenerkrankungen der Fall ist, die von der Bildung einer steiferen Matrix zu einer nachgiebigeren Struktur fortschreiten12. Bei bösartigen Blasenerkrankungen wurde über eine Versteifung berichtet, die mit einem hohen Gehalt an Kollagenfasern in der ECM einherging;13 darüber hinaus wurde bei Patienten mit rezidivierendem Tumor über eine weitere Versteifung der Blase berichtet14. Obwohl diese Studien an klinischen Proben sehr aufschlussreich sind, zeigen sie Messungen im Makromaßstab und eine Momentaufnahme der klinischen Situation.

Diese Studie konzentrierte sich auf zwei pathologische Erkrankungen der Blase: aktinische Zystitis und Urothelblasenkrebs. Aktinische Zystitis ist eine pathologische Erkrankung, die als Folge einer Beckenbestrahlung auftreten kann, die üblicherweise zur Behandlung von Prostata- und Rektumkrebs eingesetzt wird15,16. Aktinische Zystitis wird durch die Ansammlung von ECM-Proteinen aufgrund einer chronischen Entzündung verursacht, was zu Narbenbildung und Gewebeverdickung und möglicherweise zu Organversagen im Endstadium führt, mit klinisch relevanten Auswirkungen auf die Patienten4.

Blasenkrebs ist weltweit die neunthäufigste Krebserkrankung17. Es entsteht meist aus dem Urothel und wird je nach Invasion der verschiedenen Gewebeschichten in nicht-muskelinvasiven Blasenkrebs (NMIBC) und muskelinvasiven Blasenkrebs (MIBC) eingeteilt. Nach dem TNM-Klassifikationssystem18 werden NMIBC in pTa und In-situ-Karzinom (Tis) unterteilt, wenn der Tumor im Urotel vorhanden ist, und in pT1, wenn er in die Lamina propria eindringt. Umgekehrt werden MIBC in pT2 aufgespalten, wenn der Tumor die Muskelschicht erreicht, von wo aus er weiter wandern kann und in das perivesikale Gewebe (Stadium pT3) und die angrenzenden Organe (Stadium pT4) eindringt, also einschließlich Prostata, Gebärmutter und andere19. Die Fähigkeit von Krebszellen, in angrenzende Gewebe einzudringen, ist ein Kennzeichen von Krebs, und im Fall von Blasenkrebs bestimmt die Invasion der Lamina propria20 oder der Muskelschicht21 eine andere Behandlungsabwicklung. Blasenkrebszellen aus dem Urothel dringen als isolierte Einzelzellen, als einzelne Zellstränge oder als kleine Nester in das Gewebe ein22. Bei den meisten Patienten mit NMIBC kommt es zu einem Tumorrückfall und sie durchlaufen daher mehrere Interventionszyklen, die aus einer transurethralen Resektion des Blasentumors (TURBT) und einer intravesikalen adjuvanten Therapie bestehen20. Wenn der Tumor schließlich fortschreitet und auch die Muskelschicht befällt, kommen bei den Patienten möglicherweise eine radikale Zystektomie oder multimodale aggressive Behandlungen in Frage, um das Organ zu schonen21.

Klinische Bildgebungstechniken können etablierte Fibrose und anfängliche Tumorstadien erkennen, es besteht jedoch die klinische Notwendigkeit, noch frühere Krankheitsstadien zu identifizieren und eine maßgeschneidertere Nachsorge der Krankheit zu entwickeln, um bereits erste Anzeichen eines Krankheitsrückfalls zu erkennen.

Das Verständnis des Zusammenhangs zwischen mikromechanischen Merkmalen und klinischen Phänotypen bei Blasenmalignitäten kann zur Verbesserung der prognostischen Klassifizierung beitragen6. Darüber hinaus kann dieses Wissen zur Entwicklung neuartiger Therapien beitragen, die auf der Modifikation der mikromechanischen Treiber der Karzinogenese basieren6. Darüber hinaus kann ein tiefes Verständnis der mechanischen Eigenschaften einer gesunden Blase für jeden Zweck der Blasenrekonstruktion von entscheidender Bedeutung sein, mit dem Ziel, künstliche und mechanisch nachgiebige Blasen zu entwickeln15,23.

Motiviert durch die langfristige Perspektive, die mechanische Phänotypisierung von Zellen und Geweben als frühes diagnostisches Instrument für den Ausbruch und das Fortschreiten von Krankheiten wie Urothelblasenkrebs zu nutzen, führten wir Kraft-gegen-Eindrück-Messungen durch, um den Youngschen Elastizitätsmodul (YM) zu charakterisieren von Blasengewebe, ortsaufgelöst im Mikromaßstab. Da die Identifizierung mechanischer Marker für Krankheiten auf vereinfachten Protokollen und Instrumenten basieren muss, die in den Kliniken durchgeführt werden müssen, bestand unsere Strategie darin, mit einer weit verbreiteten Technik in der Mechanobiologie zu beginnen, nämlich der Rasterkraftmikroskopie (AFM), als Referenz; und dann auf die Verwendung eines Nanoindenters umzusteigen, der ein handlicheres und möglicherweise leichter auf die Kliniken übertragbares Eindringgerät für weiche Materie ist.

Daher zielte das aktuelle Projekt darauf ab, i) die statischen elastischen Eigenschaften der drei Gewebeschichten, aus denen die gesunde Blasenwand besteht, auf Mikroebene zu charakterisieren; ii) Veränderungen identifizieren, die mit dem Auftreten und Fortschreiten pathologischer Zustände (z. B. aktinische Zystitis und Blasenkrebs) verbunden sind; und iii) solche mechanischen Fingerabdrücke mit dem Goldstandard der Diagnose zu verknüpfen (dh histologische Untersuchung durch einen erfahrenen Uro-Pathologen).

Die Blasenelastizität der Maus wurde mit zwei Mikroindentationsinstrumenten gemessen: AFM und Nanoindenter. Die Blasenwand erwies sich als mechanisch inhomogen, wobei die lokalen YM-Abdeckungswerte zwischen wenigen kPa und Hunderten von kPa lagen (Abb. 1a, b). Um den Ursprung dieser mechanischen Inhomogenität zu ermitteln, untersuchten wir die Existenz eines Zusammenhangs zwischen der YM-Verteilung und den verschiedenen anatomischen Schichten der Blasenwand. Bei der Durchführung einer auf die einzelnen Gewebeschichten fokussierten AFM-basierten Einkerbung (Abb. 1a) wurde beobachtet, dass das Urothel einen mittleren YM-Wert von 16 kPa, die Lamina propria von 63 kPa und der Muskel von 72 kPa (4,20, 4,80 und 4,86) aufwiesen bzw. in Log10(YM/Pa)). In ortsaufgelösten mikromechanischen Karten, die mit dem Nanoindenter aufgenommen wurden, beobachteten wir, dass die gesunde Blasenwand durch einen Gewebesteifheitsgradienten gekennzeichnet war (Abb. 1b): Das Urothel wies den niedrigsten YM (10 kPa) auf, der beim Erreichen des zweiten Blasengewebes allmählich anstieg Schicht, der Lamina propria (100 kPa), und nahm beim Erreichen der äußeren Muskelgewebeschicht (70 kPa) vorübergehend ab (Abb. 1b). Sowohl AFM- als auch Nanoindenter-Instrumente lieferten vergleichbare YM-Werte für die verschiedenen Blasengewebeschichten, sowohl in der Physiologie (Abb. 1c) als auch in der Pathologie (für einen vollständigen Vergleich aller physiologischen und pathologischen Zustände und dreier Gewebeschichten zwischen Nanoindenter und AFM wird der Leser verwiesen zur ergänzenden Abbildung 1). Daher stammen die folgenden Ergebnisse aus Daten, die sowohl mit AFM als auch mit Nanoindenter doppelt erfasst wurden.

a YM durch AFM, dargestellt im Logarithmus zur Basis 10 (log10) in Pa für die verschiedenen Blasengewebeschichten. b Mit dem Nanoindenter ermittelte YM-Werte. Die mechanische Heterogenität der Blase korreliert mit ihrer anatomischen Verteilung: Es gibt einen Gradienten der YMs, wobei das Urothel die weichste Schicht ist, mit zunehmender Steifheit beim Erreichen der Lamina propria und dann abnehmender Steifheit über die Muskelschichten. Der Zusammenhang von Steifheitsgradienten mit den anatomischen Blasengewebeschichten wird durch Überlagerung der mechanischen Karte mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung gezeigt. Blaue Pixel weisen auf abgelehnte Messungen hin. c Mittelwert der Medianwerte einer gesunden Rattenblasenwand ± SEM, extrahiert mit den beiden Instrumenten. AFM und Nanoindenter liefern vergleichbare Ergebnisse (2-Wege-Anova-Test zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede). Für einen vollständigen Vergleich zwischen Nanoindenter und AFM wird der Leser auf die ergänzende Abbildung 4 verwiesen. d Entwicklung der Steifheit der verschiedenen Blasengewebeschichten (Urothel, Lamina propria und Muskel) mit zunehmendem Alter des erwachsenen Tieres (AFM und Nanoindenter). Daten zusammengeführt). Die Verteilung der YM-Werte für das gesamte Gewebe (dh alle Schichten zusammen) wird ebenfalls angezeigt. N = 3 Ratten pro Zeitpunkt, jede Gewebeschicht jeder einzelnen Ratte wird durch über 3000 Kraftkurvenmessungen charakterisiert. Die angezeigten Daten sind Logarithmen zur Basis 10 von YMs (in Pa). e Mittelwert der Medianwerte jeder Ratte ± SEM. Der nichtparametrische Mann-Whitney-Test zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede beim Vergleich der verschiedenen Gewebeschichten zu den untersuchten Zeitpunkten. f Quantifizierung des Blasenbereichs, der Kollagen von Kontrollratten zu verschiedenen Zeitpunkten exprimiert; Jedes Symbol stellt die Messung in einem Gewebeschnitt dar, wobei für jede Blase mehrere Schnitte bei drei Tieren gemessen wurden. Die Quelldaten hinter den Grafiken und Diagrammen finden Sie unter https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Um einen genauen Vergleich der Blasenmechanik während des Krankheitsverlaufs im Rattenmodell mit denen gesunder Tiere zu ermöglichen, haben wir hier die Entwicklung des YM einer gesunden Blase während des Alterungsprozesses der Tiere während ihres Erwachsenenlebens (d. h. ab einem Alter von 4 Monaten) charakterisiert entspricht 2 Monaten nach der Behandlung, bis 8 Monate alt, das entspricht 6 Monaten nach der Behandlung). Das Altern der Tiere im Erwachsenenalter führte zu einer allgemeinen Versteifung des Blasengewebes (Abb. 1d). Interessanterweise wurde eine solche Tendenz bestätigt, wenn man sich auf jede Gewebeschicht konzentrierte. Tatsächlich zeigte das Urothel eine sehr breite Werteverteilung, die sich mit zunehmendem Alter zu höheren Werten verschob: Im zweiten Monat konnten wir erkennen, dass das Urothel eine bimodale Verteilung aufwies, die sich im sechsten Monat zu höheren Werten bewegte, und die steifere Population wurde angereichert. Es konnte beobachtet werden, dass sich der höchste Peak der Urothelverteilungen mit dem Peak der Lamina propria überlappte, was darauf hindeutet, dass die Grenzen zwischen den verschiedenen Gewebeschichten durch Steifigkeitsübergänge und nicht durch drastische und gut getrennte Gewebegrenzen unterteilt sind.

Auch die Lamina propria folgte derselben Tendenz: Im zweiten Monat betrug der Mittelwert der Medianwerte 4,72 ± 0,2 Log10(YM/Pa), bis zu 5,18 ± 0,25 Log10(YM/Pa) im sechsten Monat (Abb. 1e). Ebenso nahm YM mit zunehmendem Alter auch für das Muskelgewebe zu und zeigte im 6. Monat eine bimodale Verteilung. Eine solche Zunahme der Steifheit korrelierte nicht mit einer Zunahme des Kollagens im Blasengewebe (Abb. 1f).

Als Modell zur Charakterisierung der mechanischen Fingerabdrücke von fibrotischem Blasengewebe wurden röntgenbestrahlte Tiere verwendet, die eine aktinische Zystitis entwickelten (Abb. 2a). Die Röntgenbestrahlung führte zu einer Zunahme der Miktionshäufigkeit und einer Abnahme des Urinvolumens pro Miktion (ergänzende Abbildung 2). Dieser biologische Effekt ging mit Elastizitätsveränderungen einher: strahleninduzierter aktinischer Zystitis als Folge von Blasenfibrose und einer dichteren ECM-Ablagerung, die einerseits zu einer Erhöhung der Blasenwandsteifheit, andererseits aber auch zu einem Elastizitätsgradienten innerhalb der Blase führte Die Blasenwand blieb erhalten (Urothel war durch den niedrigsten YM gekennzeichnet, der über der Lamina propria zunahm und beim Erreichen der äußeren Muskelschicht weiter abnahm) (Abb. 2b).

a Schematische Darstellung des Experiments: Mittels Röntgenbestrahlung wird eine aktinische Zystitis an der Blase induziert. Die Ratten werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten getötet und die Elastizität des Gewebes wird beurteilt. b Repräsentativer Blasenwandsteifigkeitsgradient, der mit dem Nanoindenter im 4. Monat erfasst wurde: Röntgenstrahlen verursachen eine Versteifung der gesamten Blasenwand im Vergleich zu nicht behandelten gesunden Tieren. Mechanische räumliche Unterschiede innerhalb der fibrotischen Blase bleiben erhalten und werden mit den verschiedenen Gewebeschichten (U: Urothel, L: Lamina propria, M: Muskel) in Verbindung gebracht. c Kinetik von YM aus röntgenbestrahlten Blasen zu verschiedenen Zeitpunkten (rot) und Vergleich mit gesunden Tieren gleichen Alters (grau), gemessen sowohl mit Nanoindenter als auch mit AFM. N = 3 Ratten pro Zeitpunkt und Bedingung, jede Gewebeschicht jeder einzelnen Ratte wurde durch über 3000 Kraftkurvenmessungen charakterisiert. Die angezeigten Daten sind Logarithmen zur Basis 10 von YMs (in Pa). d Falte der Änderung des Mittelwerts der mittleren log10-YM-Werte der Gewebeschichten behandelter Ratten im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrollratten. Der T-Test zeigte eine statistisch signifikante Versteifung im Vergleich zu den Kontrolltieren (gezeigt sind Mittelwert ± Standardabweichung mit fortschreitendem Fehler. ns=nicht signifikant, *=p-Wert < 0,05, **=p-Wert < 0,005). e Mittelwert der mittleren log10 YM-Werte der Gewebeschichten jeder Ratte ± SEM. 2-Wege-Anova zeigte keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Kinetik der Fibroseentwicklung. f) Quantifizierung des Blasenbereichs, der Kollagen von Kontrollratten und röntgenbestrahlten Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten exprimierte; Jedes Symbol stellt die Messung in einem Gewebeschnitt dar, wobei für jede Blase mehrere Schnitte bei drei Tieren gemessen wurden. Die Quelldaten hinter den Grafiken und Diagrammen finden Sie unter https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Um die Kinetik von YM nach der Bestrahlung zu charakterisieren, wurde die Blasenelastizität bestrahlter Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Behandlung analysiert und mit denen gesunder Tiere gleichen Alters verglichen. Zwei Monate nach der Behandlung war das Urothel die Gewebekomponente, die am meisten auf die Bestrahlung reagierte, wie sowohl beim Vergleich der Histogrammverteilung der Daten (Abb. 2c) als auch der fachen Änderung des Mittelwerts im Vergleich zu den Kontrollen (Abb . 2d). Die Lamina propria zeigte im Vergleich zu gleichaltrigen Kontrolltieren eine etwas engere Verteilung (Abb. 2c) sowie eine erhöhte Kollagenablagerung im Vergleich zu Kontrolltieren (Abb. 2f). Die Muskelschicht zeigte zu diesem Zeitpunkt keine Unterschiede.

Vier Monate nach der Bestrahlungsbehandlung zeigte das Urothel eine große Streuung der Moduli, vergleichbar mit der gleichaltrigen Kontrolle (Abb. 2c). Im Gegensatz dazu schienen sowohl die Lamina propria als auch die Muskelschichten besonders auf den fibrotischen Prozess zu reagieren: Tatsächlich wirkten beide steifer und enger verteilt als ihre gesunden Gegenstücke (Abb. 2c). Ebenso wurden im Vergleich zum vorherigen Zeitpunkt höhere Mittelwerte beobachtet (Abb. 2e). Beim Vergleich der Mittelwerte der Medianwerte der Verteilungen mit gesunden Gegenstücken waren die Lamina propria und der Muskel steifer (Abb. 2d), was mit einer erhöhten Kollagenablagerung auf den fibrotischen Blasen einherging (Abb. 2f).

Beim Vergleich des YM-Profils von Monat 4 mit Monat 6 verschob sich die Verteilung nicht signifikant in Richtung höherer YM-Werte (Abb. 2c), was darauf hindeutet, dass der Schaden über die Zeit stabil bleibt und zu einem späteren Zeitpunkt keine weitere Versteifung verursacht (Abb. 2e). ). Aufgrund der physiologischen Alterung der Blase, die zu einer Versteifung führt, waren die Unterschiede zwischen bestrahlten und gesunden Tieren bei älteren Tieren tatsächlich weniger drastisch, da der Behandlungseffekt wahrscheinlich durch die Alterung der Tiere verdeckt wurde und eine Versteifung nur für das Urothel berichtet wurde (Abb. 2d). Die Kollagenquantifizierung im Gewebe bestrahlter Tiere zeigte einen Anstieg der Kollagenablagerung im Vergleich zu nicht behandelten Tieren im 2. und 4. Monat, jedoch nicht im 6. Monat (Abb. 2f). Ältere behandelte Tiere zeigten jedoch eine weniger breite Verteilung, was darauf hindeutet, dass die Abnahme der Steifigkeitsheterogenität durch den Ersatz von Gewebekomponenten durch Kollagen aufgrund einer fibrotischen Reaktion verursacht wurde.

Interessanterweise beobachteten wir, dass das mikromechanische Profil eines der bestrahlten Tiere keine Auswirkung auf die Versteifung zeigte und mit denen der gesunden Kontrolltiere gleichen Alters (4 Monate nach der Behandlung) vergleichbar war (Abb. 3a). Nach der histologischen Analyse und der Beurteilung der Fibrose bestätigten wir, dass dieses spezifische Tier keine Blasenfibrose entwickelt hatte (Abb. 3b). Damit unterstrichen wir das Potenzial der Mikroindentation zur Erkennung von durch Bestrahlung verursachter Fibrose und zeigten, dass in Abwesenheit der Mikroindentation keine Versteifung festgestellt werden konnte histologischer fibrotischer ECM-Ablagerungen.

a Das mikromechanische Profil (blau) war vergleichbar mit dem von gesunden Kontrollgeweben gleichen Alters (4 Monate nach der Bestrahlung) (grau). b Die histologische Analyse zeigte eine dichtere Ablagerung von ECM (*) bei einem auf Röntgenstrahlen reagierenden Tier (links), begleitet von einer Zunahme der Steifheit. Die Histologie der Blase ohne Versteifung (rechts) ergab, dass keine fibrotische Schädigung vorlag (4 Monate nach der Bestrahlung). Die Quelldaten hinter den Grafiken und Diagrammen finden Sie unter https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Um den Einfluss der Tumorentwicklung und -progression auf die Blasenmechanik zu untersuchen, wurde die Entwicklung der Blasenelastizität an einem orthotopen Rattenmodell untersucht, bei dem Ratten mit Wasser getränkt wurden, das das blasenspezifische Karzinogen Nitrosamin (BBN) enthielt (Abb. 4a). . Dieses Modell ermöglicht die Überwachung aller Stadien der Entwicklung und des Fortschreitens von Blasenkrebs und ahmt so die pathologischen Prozesse nach, die beim Menschen ablaufen.

a) Etablierung eines Tiermodells. Repräsentative Blasenwandsteifigkeitsgradienten, die mit einem Nanoindenter nach (b) 2 Monaten BBN-Behandlung erfasst wurden, wobei die Urotheldysplasie mit * markiert ist; (c) 4 Monate BBN-Behandlung, wobei ein pTa-Tumor, der auf das Urothel beschränkt ist, ohne in die Lamina propria einzudringen, mit ** gekennzeichnet ist. pT1-Tumoren, bei denen urotheliale Tumorzellen die Basalmembran durchbrechen und in die darunter liegende Lamina propria eindringen, sind nach 4 und (d) 6 Monaten BBN-Behandlung mit *** gekennzeichnet. U: Urothel, L: Lamina propria, M: Muskel. YMs aus BBN-behandelten Blasen (schwarz) nach (e) 2 Monaten, (f) 4 Monaten und (g) 6 Monaten BBN-Behandlung; und Vergleich mit gesunden Tieren gleichen Alters (grau), gemessen sowohl mit Nanoindenter als auch mit AFM. N = 3 Ratten pro Zeitpunkt und Bedingung, jede Gewebeschicht jeder einzelnen Ratte wird durch über 3000 Kraftkurvenmessungen charakterisiert. Die angezeigten Daten sind Logarithmen zur Basis 10 von YMs (in Pa). h Falte der Änderung des Mittelwerts der mittleren log10-YM-Werte der behandelten Ratten ± Standardabweichung (mit propagiertem Fehler) im Vergleich zu Kontrollratten. Der T-Test zeigte eine statistisch signifikante Erweichung im Vergleich zu den Kontrolltieren (gezeigt sind Mittelwert ± Standardabweichung mit fortschreitendem Fehler). ns=nicht signifikant, *=p-Wert < 0,05, **=p-Wert < 0,005, ***=p-Wert < 0,0005). i Mittelwert der Medianwerte jeder Ratte. 2-Wege-Anova zeigte, dass statistisch signifikante Unterschiede im BBN-Modell im Urothel von Monat 2 bis Monat 4 und von Monat 4 bis Monat 6 beobachtet wurden; und für die Lamina propria von Monat 4 bis Monat 6. Die Quelldaten hinter den Grafiken und Diagrammen finden Sie unter https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Nach zweimonatiger BBN-Behandlung zeigte das Blasengewebe eine geringgradige Dysplasie, was bedeutet, dass es Epithelzellen mit abnormaler Organisation gab (Abb. 4b). Das Vorhandensein abnormaler Zellen beschränkte sich auf das Urothel, das dessen Dicke und Zellularität erhöhte, ohne in die darunter liegende Lamina propria einzudringen. Darüber hinaus aktiviert das BBN Entzündungswege in der Blase. In diesem Stadium waren dysplastische Blasengewebe durch eine Elastizitätsveränderung des Urothels gekennzeichnet, die mit einer Verbreiterung der Zellschicht und dem Vorhandensein abnormaler Zellen einherging (Abb. 4b, e). Die Lamina propria und die Muskelschichten zeigten YM-Profile, die denen gleichaltriger Kontrolltiere entsprachen, und das Gesamtgewebe unterschied sich nicht wesentlich vom gesunden Blasengewebe.

Nach 4-monatiger BBN-Behandlung wiesen die Blasengewebe nicht-invasive Tumoren auf, die im Urothel lokalisiert waren (pTa), und es gab wenige Punkte einer fokalen Invasion, an denen einige Zellgruppen oberflächlich in die darunter liegende Lamina propria eindrangen (pT1) (Abb. 4c). ). Diese Blasengewebe zeigten eine Erweichung im Urothel im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 4f) mit einer 0,81-fachen Veränderung (Abb. 4h) sowie in der Lamina propria, die eine sehr breite Steifigkeitsverteilung aufwies (0,78-fache Veränderung). Es konnte festgestellt werden, dass sich die Elastizitätsverteilung des Muskels im Vergleich zum gesunden Muskel leicht in Richtung niedrigerer YM-Werte zu verschieben begann, mit einer 0,87-fachen Änderung im Vergleich zum Kontrollmuskelgewebe, obwohl Krebszellen noch nicht in diese Gewebeschicht eingedrungen waren. Die YM-Verteilung des gesamten Gewebes war durch ein bimodales Profil gekennzeichnet: ein niedrigerer Peak, der dem Vorhandensein von Tumorzellen im Urothel und in der Lamina propria entsprach, und ein steiferer Peak, der der Muskelgewebeschicht ohne das Vorhandensein von Tumorzellen entsprach , die teilweise mit dem gesunden Gewebe überlappte (Abb. 4f).

Nach 6 Monaten BBN-Behandlung waren Tumorzellen in der Lamina propria (pT1) vorhanden (Abb. 4d). Außerdem waren zu diesem Zeitpunkt die behandelten Blasen durch eine Verschiebung der Elastizitätsverteilung zu weicheren Werten für Urothel und Lamina propria gekennzeichnet (Abb. 4g). Das Muskelgewebe wies eine bimodale Verteilung auf, wobei ein Peak zu niedrigeren Werten verschoben war und ein zweiter Peak mit denen einer gesunden Blase überlappte (Abb. 4g). Wahrscheinlich aufgrund der physiologischen Alterung der Tiere, die zu einer Erhöhung der Gewebeelastizität führte, waren die Faltenveränderungen im Vergleich zu den Kontrollen weniger dramatisch, da die Lamina 0,93 weicher und die Muskeln 0,90 weicher waren (Abb. 4h). Wir gingen davon aus, dass der Hauptgrund für diese Blasenerweichung das Vorhandensein von Tumorzellen im Gewebe war, von denen allgemein bekannt ist, dass sie weicher sind als ihre gesunden Gegenstücke. Dennoch wurde vor der Tumorzellinvasion eine Erweichung der verschiedenen Schichten festgestellt (für Lamina und Muskel im 4. Monat und für den Muskel im 6. Monat). Insgesamt war die neoplastische Mikroumgebung weicher als die von gesunden Tieren, selbst wenn dieser weichmachende Effekt mit der physiologischen Alterung dieser Tiere kombiniert wurde.

Nachdem wir die Mechanik von Blasentumoren am Mausmodell untersucht hatten, das eine genauere Nachverfolgung von Tumoren im Frühstadium ermöglicht, charakterisierten wir das mikromechanische Profil eines hochwertigen MIBC eines Patienten, der sich einer radikalen Zystektomie unterzogen hatte. In diesem Zusammenhang untersuchten wir paarweise chirurgische Proben, darunter das von neoplastischen Zellen infiltrierte Muskelgewebe und das nicht infiltrierte Muskelgewebe. Diese Strategie ermöglicht die Charakterisierung von neoplastischem und nicht-neoplastischem Gewebe, vermeidet jedoch Schwankungen zwischen den Spendern. Normales Muskelgewebe zeichnete sich durch ein YM aus, das nach logarithmischer Transformation ungefähr einer Gaußschen Verteilung folgte, mit einem Medianwert von 3,52 Log10(YM/Pa) (33 kPa im linearen Maßstab), während die neoplastische Infiltration von Tumorzellen auf dem Muskelgewebe zu einem YM führte Zunahme der mechanischen Heterogenität und eine allgemeine Erweichung des Gewebes (Medianwert von 3,28 Log10(YM/Pa), 2 kPa im linearen Maßstab) (Abb. 5).

a Hämatoxylin-Eosin-Färbung von muskelinvasivem Blasenkrebs und paarigem nicht-neoplastischem Muskelgewebe eines Patienten mit hochgradigem Urothelkarzinom. b Mechanisches Profil von neoplastischem (orange) und nicht-neoplastischem (blau) Muskelgewebe desselben Patienten (n = 1). Mit dem Nanoindenter gesammelte Daten. Die Daten werden als Logarithmus zur Basis 10 der YMs (in Pa) angezeigt. Die Quelldaten hinter den Grafiken und Diagrammen finden Sie unter https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222.

Diese Studie beschreibt die Mechanik der drei Gewebeschichten der Blase im Mikromaßstab und enthüllt so die Heterogenität in Bezug auf die Elastizität der drei Gewebeschichten, die Gewebeversteifung bei aktinischer Zystitis und die Erweichung aller drei Schichten während des Ausbruchs und Fortschreitens von Blasenkrebs. Durch die Charakterisierung der Mechanik auf Mikroebene haben wir hier neue Informationen zu Veränderungen in der neoplastischen Umgebung je nach Art der Invasion von Blasenkrebs durch einzelne Zellen oder kleine Zellcluster bereitgestellt.

Nach unserem besten Wissen haben wir in dieser Studie die erste räumliche und zeitliche mikromechanische Kartierung der gesamten Blasenwand mit räumlicher Auflösung im Mikrometerbereich sowohl im Gesundheitszustand als auch bei aktinischer Zystitis und Blasenkrebs durchgeführt. Die hier verwendete Methodik war zunächst AFM, der Goldstandard in der Mechanobiologie zur Untersuchung der Zellmechanik. Dennoch muss sich die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Geweben mit größeren Probenbereichen befassen, was einen größeren Testumfang, eine größere Oberflächenrauheit und eine größere mechanische Heterogenität der Probe bedeutet. Dies erfordert erstens einen größeren Z-Piezobereich und zweitens eine geschlossene Eindringschleife, um alle mechanischen Heterogenitäten zu messen (um sehr weiche und sehr steife Bereiche innerhalb eines großen Probenahmebereichs zu untersuchen). Andererseits wurde bereits früher berichtet, dass bei der Untersuchung der auf Nanoindentation basierenden Mechanik Replikationsprobleme auftreten, die auf Zellebene überwunden wurden24, jedoch noch nicht auf Gewebeebene. Um die technischen Herausforderungen beim Testen solch komplexer Proben zu überwinden und die Robustheit und Reproduzierbarkeit unserer Ergebnisse sowie deren eventuelle Übertragung auf die Kliniken zu erhöhen, haben wir hier zwei indentationsbasierte Instrumente kombiniert: AFM und einen Nanoindenter, der diese überwindet technische Details und ermöglicht die Validierung unserer eigenen Daten.

Wir haben gezeigt, dass die Blasenwand ein hochmechanisches heterogenes Gewebe ist, das durch einen Steifigkeitsgradienten vom Urothel zur Lamina propria und zur Muskelschicht gekennzeichnet ist. Wir haben auch einen Einfluss des Alterns auf die Gewebemechanik gezeigt, der bekanntermaßen die Histologie der Mausblase verändert25. Das Verständnis der Gewebemechanik und der Verteilung entsprechend den verschiedenen anatomischen Gewebeschichten – wie es zuvor für Organe wie die Hornhaut26 oder die Haut27 berichtet wurde – ist auch für die Blase von Bedeutung, da ihre physiologische Funktion hohe elastische Spannung und mechanische Beanspruchung umfasst und dies möglicherweise auch der Fall ist für die Blasenrekonstruktion von entscheidender Bedeutung sein.

Fibrose resultiert aus der pathologischen Ansammlung von ECM-Proteinen aufgrund einer chronischen Entzündung, die zu Narbenbildung und Verdickung des Gewebes und schließlich zum Organversagen führt15. Mithilfe von Röntgenbestrahlung haben wir ein Tiermodell der aktinischen Zystitis erstellt, um die mechanischen Fingerabdrücke des fibrotischen Blasengewebes zu charakterisieren. Anhand der Histogrammdarstellung des YM konnten wir eine Versteifung des Urothels 2 Monate nach der Bestrahlung feststellen, was darauf hindeutet, dass die Hauptwirkung der Bestrahlung auf den Zellen lag, von denen bekannt ist, dass sie Zellapoptose induzieren28, und es wurde bereits früher berichtet, dass dies bei apoptotischen Zellen der Fall ist steifer29. Zum zweiten untersuchten Zeitpunkt, also nach 4 Monaten, kam es in Übereinstimmung mit einer früheren Studie zu einer Versteifung der Lamina propria und des Muskels30. Das YM des 6 Monate alten bestrahlten Tieres veränderte sich im Vergleich zum 4 Monate alten Tier nicht, während die Mechanik der Blase beim Kontrolltier im Alter von 4 auf 6 Monate zunahm, was die Wirkung der Behandlung verdeckte.

Die Untersuchung der Gewebeelastizität mittels Mikroindentation konnte auch das Fehlen einer Blasenfibrose bei einem bestrahlten Tier, das keine aktinische Zystitis entwickelte, nachweisen. Diese Informationen unterstützen das diagnostische Potenzial der Quantifizierung der Gewebeelastizität im Mikromaßstab, die genutzt werden könnte, um detailliertere Informationen über das reaktive Stroma zu erhalten, das für fibrotische Prozesse charakteristisch ist und normalerweise mit histologischen Techniken untersucht wird.

Wir beobachteten auch einen Anstieg der Gewebecompliance bei Vorhandensein eines Blasentumors, sowohl im Rattenmodell als auch beim Menschen, ähnlich dem, was für Leberkrebsgewebe berichtet wurde31. Im Prinzip scheint diese Beobachtung kontrovers zu sein und steht im Widerspruch zur allgemeinen Tendenz solider Tumoren (d. h. Brustkrebs32 und Lungenkrebs33, dominiert durch kollektive Zellinvasion34), bei denen es normalerweise zu einer Versteifung kommt. Eine Gewebeversteifung wird auch bei der Untersuchung urologischer Organe wie der Prostata oder des Hodens mit nicht-invasiven makroskaligen Techniken beobachtet4. Dennoch konnten wir hier durch die Bereitstellung räumlich aufgelöster mikromechanischer Karten den Beitrag von Zellen und ECM zur Gewebeelastizität messen. Beim MIBC-Tumor fanden wir eine Zunahme der Heterogenität der Gewebeelastizität, wenn das Gewebe von neoplastischen Zellen befallen wird, wie bereits zuvor für Brustkrebs berichtet32. Darüber hinaus wurde bereits früher festgestellt, dass Tumorzellen weicher sind als ihre gutartigen Gegenstücke und dass die Erweichung von Krebszellen mit zunehmender Malignität zunimmt35.

Andererseits wird die ECM-Versteifung zunehmend als ein wichtiges mechanisches Signal erkannt, das das Zellverhalten verändert und teilweise Krebszellen charakteristische Fähigkeiten verleiht, darunter nachhaltiges Wachstum, Invasion und Metastasierung36. Ein solcher Anstieg der ECM-Steifheit ist hauptsächlich mit einer erhöhten Kollagenablagerung37,38 verbunden, insbesondere an der invasiven Vorderseite von Tumoren, die außerdem oft der steifsten Region des Tumorgewebes entspricht39. Ein Beispiel für tumorales fibrotisches Stroma ist Brustkrebs, bei dem Brusttumoren durch eine erhöhte Kollagenablagerung zusammen mit einer erhöhten Linearisierung und Verdickung der Kollagenfasern gekennzeichnet sind40,41. Tumoren, die durch fibrotische Stromaablagerungen gekennzeichnet sind, sind bekanntermaßen steifer, beispielsweise Brust- und Bauchspeicheldrüsentumoren42. Darüber hinaus wurde für NMIBC-Patienten ein Zusammenhang mit COL1A1 und COL1A243 berichtet. Daher wäre es letztendlich interessant, dezellularisiertes Blasengewebe zu untersuchen, um den Beitrag der ECM zur Steifheit des gesamten Organs zu untersuchen und mögliche Zusammenhänge mit der Zunahme der Kollagenexpression zu untersuchen, die bei Patienten mit nicht muskelinvasivem Blasenkrebs mit schlechter Prognose berichtet wurde43.

Darüber hinaus wandern Krebszellen bei Blasentumoren als einzelne Zellen oder kleine Nester33, im Gegensatz zu Tumoren, bei denen über eine Versteifung berichtet wird, z. B. Brust-, Prostata- und Lungenkrebs33. Die Invasion einzelner Zellen kann in mesenchymale und amöboide Migration unterteilt werden33. Nur wenige Studien haben gezeigt, dass muskelinvasiver Blasenkrebs eine erhöhte Kontraktilität von Zellen durch amöboide Migration fördert, die im Gegensatz zur mesenchymalen Migration stattfindet, wenn die umgebende Matrix relativ weich ist44. Durch die Untersuchung der Elastizitätsprofile von Blasentumoren im Rattenmodell stellten wir eine Erweichung der Gewebeschichten unter dem Tumor fest, als der Tumor noch nicht eingedrungen war. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gewebeschichten einem mechanischen Umbau unterzogen werden, bevor sie von den Tumorzellen befallen werden. Dies unterstreicht das klinische Potenzial der Messung der Gewebeelastizität durch Mikroindentation für die Frühprognose von Blasenkrebs. Diese Beobachtung steht im Einklang mit einer früheren Studie, die berichtet, dass die mechanische Umgestaltung des Gewebes um neoplastische Zellen der Invasion in Plattenepithelkarzinom-Sphäroiden im Kopf- und Halsbereich vorausgeht45. Weitere Tests an klinischen Proben sind erforderlich, um die hier gewonnenen Informationen durch die Untersuchung der Gewebemechanik anhand eines präklinischen Modells zu validieren.

Eine Einschränkung unserer Studie besteht darin, dass Blasenproben vor den mechanischen Messungen eingefroren wurden. Auch wenn keine chemische Behandlung durchgeführt wurde und die Proben als frisch/gefroren galten, kann nicht ausgeschlossen werden, dass beim Einfrieren/Auftauen Artefakte auf den Proben entstehen könnten, was die Möglichkeit von Auswahlverzerrungen erhöht. Um diesen Effekt zu reduzieren, verwendeten wir ein Kryoschutzmittel (OCT), das die Probe vor der Bildung von Eiskristallen schützt, und verwendeten ein Schnellgefrierprotokoll. Darüber hinaus haben wir hier eine Vergleichsstudie zwischen verschiedenen Bedingungen durchgeführt, sodass die Proben immer einem identischen Protokoll unterzogen wurden. Frühere Studien haben nur geringe Auswirkungen auf die mechanischen Eigenschaften beim Gefrieren von Gewebe gezeigt46. Die Arbeit mit gefrorenem Gewebe hat jedoch mehrere Vorteile, und in verschiedenen AFM-Studien wurden frisch gefrorene klinische Proben verwendet27,47,48,49,50. Darüber hinaus ermöglicht gefrorenes Gewebe die Herstellung von Halbdünnschnitten, die eine histologische Analyse und Korrelation mit der histologischen Untersuchung ermöglichen.

Eine weitere Einschränkung unserer Arbeit hat mit der mechanischen Modellierung zu tun: Bei der Schätzung der elastischen Eigenschaften haben wir viskose Effekte vernachlässigt. Wir gingen davon aus, dass die von uns gemeldeten Werte als charakteristisch für eine niederfrequente Materialreaktion angesehen werden können, bei der viskose Effekte eine vernachlässigbare Rolle spielen. Dennoch gibt der Elastizitätsmodul nur einen teilweisen Einblick in die mechanische Reaktion des Materials. Beispielsweise wurde in einer aktuellen Arbeit51 hervorgehoben, wie sich unterschiedliche Mengen an Kollagen sowohl auf die Gewebesteifigkeit als auch auf die Viskosität in Zellaggregaten auswirken. Zukünftige Studien sollten sich auf die Charakterisierung schichtspezifischer viskoelastischer Effekte konzentrieren.

Diese Studie verdeutlicht die intrinsische mechanische Heterogenität der verschiedenen Blasenschichten. Durch die Bereitstellung hochauflösender mikromechanischer Karten, die die drei anatomischen Schichten der Blase berücksichtigen, berichten wir über eine Veränderung der mechanischen Eigenschaften des Blasengewebes bei den pathologischen Zuständen aktinischer Zystitis und Tumor. Solche mechanischen Fingerabdrücke könnten schließlich den Weg für zukünftige klinische Diagnose- und Prognoseinstrumente ebnen und mögliche Hinweise für die Blasenrekonstruktion liefern.

Weibliche Fischer-Ratten wurden gemäß dem Ethikprotokoll Nr. 1114 behandelt. Um eine physiologische Dehnungsbelastung der Blase hervorzurufen, wurde vor der Tötung der Tiere eine Ultraschallbildgebung (US) durchgeführt, um auf das Instillationsvolumen zu schließen, das einer physiologisch gedehnten Blase entspricht (Abb. 6 und ergänzende Abb. 3). Die US-Bildgebung wurde auf einer Vevo3100 LAZR-X Imaging Station durchgeführt, die mit einem MX250D-Wandler (FUJIFILM VisualSonics, Amsterdam, Niederlande) ausgestattet war. Das US-Signal wurde unter Verwendung der folgenden Einstellungen erfasst, indem axiale Schnitte der Rattenblase erfasst wurden: Frequenz: 21 MHz; Verstärkung: 15 dB; Schrittweite: 200 µm. B-Mode-3D-Ultraschallbilder der Rattenblase wurden mit der Software VevoLab 3.2.5 aufgenommen und analysiert.

Probenvorbereitungsprotokoll und Versuchsablauf. Zunächst wird eine Ultraschallbildgebung (US) durchgeführt, um das physiologische OCT-Kryoschutzmittel-Blaseninstillationsvolumen zu bestimmen. Anschließend werden die Tiere getötet, das Kryoschutzmittel über einen Katheter in die Blase eingeträufelt und die Blase anschließend entnommen und eingefroren. Es werden Kryoschnitte angefertigt und Mikroindentationsexperimente an den Gewebeträgern sowohl mittels AFM als auch mittels Nanoindenter durchgeführt. Anschließend wurde eine histologische Analyse durchgeführt, um die Lage der anatomischen Blasenschichten zu bestätigen.

Zwei Monate alte, 150–175 Gramm schwere weibliche Fisher-Ratten (Charles River, Deutschland) wurden in der Tierhaltung des IRCCS San Raffaele Hospital unter Standardbedingungen (Temperatur: 22 °C ± 2; Luftfeuchtigkeit: 50 ± 10 %; hell/dunkel) gehalten Zyklus: 12 h hell und 12 h dunkel). Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden die Ratten röntgenbestrahlt. Die Tiere wurden mit Isofluoran 2–4 % 0,3–0,8 l anästhesiert und die Blase durch einen PE50-Katheter mit 450 µl steriler Kochsalzlösung gefüllt52. Die Blase wurde mit einer einzigen Strahlung von 20 Gy bestrahlt. Die Strahlungsdosis wurde mithilfe eines speziellen Kleintier-Mikrobestrahlungsgeräts (X-RAD225Cx SmART, PXI North Branford, CT, USA) mit Führung durch Mikrokegelstrahl-Computertomographie (CBCT) abgegeben. Die anästhesierten Ratten wurden in Bauchlage auf dem Tierstadium positioniert und CBCT-Bilder wurden mit den folgenden Einstellungen aufgenommen: Röhrenspannung = 40 kVp, Strom = 5 mA, Voxelgröße = 0,2 mm3. Die Blase wurde im CT-Scan konturiert und drei gleich große Dosisstrahlen wurden unter Verwendung eines Kollimators von 10 × 10 mm2 in einem Winkel von 130°, 180° bzw. 230° eingestellt. Die Dosisverteilung wurde mithilfe eines Monte-Carlo-Algorithmus53 berechnet und die mittlere Dosis für die Blase wurde an die verschriebene Dosis von 20 Gy angepasst. Die Bestrahlungseinstellungen waren: Röhrenspannung = 225 kVp, Strom = 13 mA. Die Abgabezeit betrug ungefähr 2 bis 5 Minuten/Feld und der gesamte Eingriff (CT-Bildgebung und Strahlentherapie) wurde innerhalb von 20–25 Minuten/Tier durchgeführt. Die Ratten wurden dann 2, 4 und 6 Monate nach der Strahlentherapie getötet (3 Ratten pro Zustand) und die Blasen wurden für die Histologie und mechanische Tests vorbereitet.

Zwei Monate alte weibliche Fisher-Ratten (Charles River, Deutschland) wurden in der Tierhaltung des IRCCS San Raffaele Hospital unter Standardbedingungen (Temperatur: 22 °C ± 2; Luftfeuchtigkeit: 50 ± 10 %; Hell-/Dunkelzyklus: 12 Stunden) gehalten hell und 12h dunkel). Nach einer einwöchigen Akklimatisierungsphase wurden die Ratten gleichmäßig in zwei Gruppen aufgeteilt: eine Gruppe (Tumor), die mit 0,05 % N-(4-Hydroxybutyl)nitrosamin (BBN; Sigma Aldrich) getränkt wurde, und die zweite Gruppe (Kontrolle). mit normalem Wasser bewässert. Die Ratten wurden dann 2, 4 und 6 Monate nach Beginn der Behandlung getötet (3 Ratten pro Zustand) und die Blasen wurden für die Histologie und mechanische Tests vorbereitet.

Alle Verfahren und Studien mit Tieren wurden gemäß den vom IRCCS Ospedale San Raffaele Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen und in Übereinstimmung mit nationalen und internationalen Standardrichtlinien durchgeführt.

Von einem Patienten (männlich, 62 Jahre, mit MIBC-pT2 G3) wurden über die Abteilung für Pathologie des IRCCS Ospedale San Raffaele (Mailand, Italien) gepaarte Proben von nicht-neoplastischem Gewebe und Urothelkarzinom der Blase entnommen. Eine formelle schriftliche Zustimmung wurde vom örtlichen Institutional Review Board (Ethikkommission IRCCS Ospedale San Raffaele; geänderte Version des URBBAN-Protokolls genehmigt im November 2020) eingeholt. Die Datenerfassung und alle Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission IRCCS Ospedale San Raffaele gemäß den relevanten Richtlinien und Vorschriften der Deklaration von Helsinki genehmigt. Alle Methoden wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt. Alle Patienten unterzeichneten eine schriftliche Einverständniserklärung, in der sie sich bereit erklärten, ihre eigenen anonymen Informationen für diese und zukünftige Studien bereitzustellen.

Bei den Rattenproben wurde eine Ultraschalluntersuchung der Blase durchgeführt, um das Instillationsvolumen zu charakterisieren, das eine physiologische Dehnung der Blase verursacht. Die Tiere wurden dann durch CO2 eingeschläfert und durch Blasenkatheterisierung (22-G-Kanüle, BD, Italien) wurde das Kryoschutzmittel OCT (Bio-Optica, IT) in die Blase eingeträufelt (Volumen, das zuvor durch US-Bildgebung definiert wurde und je nach Bedarf zwischen 200 und 400 µl liegt). Größe und Dehnbarkeit jeder Blase) (Abb. 6). Die Harnröhre wurde verschlossen und die Blase explantiert. Um die Integrität der Proben zu bewahren, wurden die Blasen in Gewebeeinbettungsmedium (OCT Compound for Cryostat Sectioning) bei –80 °C (Isopentan und Trockeneis) eingefroren54. Menschliche Proben wurden auf die gleiche Weise eingefroren.

Für die mechanische Analyse wurden 50 µm dicke Gewebeschnitte mit einem Mikrotom-Kryostat hergestellt und die frisch eingefrorenen Schnitte bei Raumtemperatur auf polarisierten Superfrost-Glasobjektträgern aufgetaut, um sie für mechanische Messungen zu immobilisieren. Das OCT wurde vor dem mechanischen Test mit Phosphatpufferlösung (PBS) gewaschen. Für umfassende histologische Analysen wurden paarweise 10 µm dicke Gefrierschnitte aufgetaut, mit Formalin fixiert und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt.

Der Young-Modul (YM) von Blasengewebeproben wurde mit dem Chiaro-Nano-Eindringkörper (Optics11) und dem Biscope Catalyst AFM (Bruker) charakterisiert. Während beide Instrumente hinsichtlich der gemessenen YM-Werte ähnliche Ergebnisse liefern, liegt der Hauptunterschied zwischen den beiden Techniken in der Vorrichtung, die zur Messung der auf die Probe ausgeübten Kraft verwendet wird (Abb. 7).

Der Hauptunterschied zwischen beiden Eindruckmessgeräten besteht im z-Piezobereich, der Erkennung der Cantilever-Auslenkung und dem festen Parameter während der Messung.

Die Werte des Elastizitätsmoduls der verschiedenen Schichten des Blasengewebes wurden bestimmt, indem das Hertz-Modell55,56 an Sätze von Kraft-Eindrückungskurven (einfach Kraftkurven, FCs) angepasst wurde, die mit AFM an 50 µm dicken Gewebeschnitten erfasst wurden, wie an anderer Stelle beschrieben24,57. 58, was genau ist, solange der Eindruck δ klein im Vergleich zum Radius R ist:

In Gl. (1), ν ist der Poisson-Koeffizient, der für inkompressible Materialien typischerweise mit 0,5 angenommen wird, und E ist der Elastizitätsmodul.

Kundenspezifische monolithische Borosilikatglassonden, bestehend aus kugelförmigen Glasperlen (SPI Supplies) mit Radien R im Bereich von 5–10 µm, wurden an spitzenlosen Auslegern (Nanosensor, TL-FM) mit einer nominellen Federkonstante k = 3–5 N/ befestigt. M. Die Sonden wurden im Hinblick auf den Spitzenradius gemäß einem etablierten benutzerdefinierten Protokoll59 hergestellt und kalibriert. Schwankungen im Kontaktradius waren auf die technische Verfügbarkeit der einzelnen Sonden während der Messungen und auf interne Schwankungen der Glaskügelchen (innerhalb derselben Charge) zurückzuführen, die zur Herstellung der kolloidalen Sonden verwendet wurden. Die Federkonstante des Auslegers wurde mithilfe der Kalibrierungsmethode für thermisches Rauschen60,61 gemessen und um den Beitrag der zusätzlichen Masse der Kugel62,63 korrigiert. Die Ablenkungsempfindlichkeit wurde vor jedem Experiment in situ und nichtinvasiv kalibriert, indem die zuvor charakterisierte Federkonstante als Referenz gemäß dem SNAP-Verfahren24 verwendet wurde.

Alle mechanischen Messungen wurden mit in PBS-Lösung eingetauchten Gewebeproben durchgeführt. Sätze von FCs (Kraftvolumina oder FVs) wurden in ausgewählten interessierenden Regionen gesammelt, die mithilfe der genauen Ausrichtung von optischen und AFM-Bildern identifiziert wurden, die mit dem in die AFM-Software integrierten Miro-Softwaremodul erhalten wurden. Der optische Zugang und das Design der Gewebeschnitte ermöglichten es, die Sonde direkt über die verschiedenen Schichten der Blase (Urothel, Lamina propria, Muskelschicht) zu bewegen und die interessierenden Regionen zu lokalisieren, um sie auf lokale mechanische Eigenschaften zu analysieren.

Jedes FV bestand typischerweise aus einem Array von 144–225 FCs, die räumlich um 5–10 μm voneinander getrennt waren, wobei jeder FC 8192 Punkte enthielt, mit einer Rampenlänge L = 6–10 μm, einer maximalen Last Fmax = 200–1500 nN und einer Rampenfrequenz f = 1 Hz. Die maximale Belastung wurde angepasst, um einen typischen maximalen Eindruck im Bereich von etwa 2–5 μm zu erreichen. Die typische Annäherungsgeschwindigkeit der Sonde während des Eindrucks betrug 12–20 µm/s.

Jede Gewebeschicht wurde durch das Sammeln von mindestens 15 unabhängigen FVs in verschiedenen makroskopisch getrennten Regionen von Interesse auf drei verschiedenen Gewebeschnitten für jede Ratte (dh für jedes verschiedene Blasenorgan) charakterisiert. Gewebeschnitte aus dem mittleren Bereich der Blase wurden ausgewählt, um die Blasenwanddicke zu normalisieren (Blasenquerschnitte näher an den Enden der Blase weisen eine dickere Muskelschicht auf). Um eine Verzerrung aufgrund der Probenahme eines bestimmten Bereichs der Blase zu vermeiden, wählten wir außerdem nach dem Zufallsprinzip mindestens vier Stellen innerhalb jedes untersuchten Gewebeabschnitts aus, um die drei Gewebeschichten zu beproben, wobei wir die vier Himmelsrichtungen des Gewebeabschnitts als Referenz verwendeten. Insgesamt ist jede Schicht durch mehr als 2000 FCs pro einzelnem Organ gekennzeichnet. Die Datenanalyse wurde wie zuvor an anderer Stelle beschrieben durchgeführt64.

Nach dem mechanischen Test wurden Gewebeschnitte auf 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und an derselben Scheibe eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung durchgeführt, um eine retrospektive Bestätigung der anatomischen Lage jeder einzelnen interessierenden Region zu liefern, die während des Nanoindentationsexperiments gemessen wurde ( Abb. 6).

Mechanische Karten an Mäuseblasen wurden mit einem Chiaro-Nanoindenter (Optics11 BV) in mindestens drei gut getrennten Bereichen in jedem gesammelten Schnitt gesammelt. Bezüglich der Abmessungen wurde eine Pixelgröße von 10 µm mit einer Gesamtabmessung der Karte von 100 µm in tangentialer Richtung (durch die verschiedenen Schichten) und der Länge gewählt, die erforderlich war, um die gesamte Dicke der Blasenwand vom Urothel bis zum Muskel abzudecken ( typischerweise einige 100 µm).

Die mechanische Charakterisierung menschlicher Blasenproben wurde mit demselben Chiaro-Nanoindenter durchgeführt. In den drei verschiedenen Gewebeschichten wurden Karten von bis zu 1 mm x 1 mm (Pixelgröße 10 µm) aus zwei verschiedenen Gewebestücken pro Blase gesammelt. Pro Gewebestück wurden drei bis fünf Gewebeschnitte gemessen. Das Hertz-Modell (Gl. 1) wurde an die Kraftkurven angepasst.

Die Gewebe wurden unter Verwendung von Auslegern mit einer Federkonstante von ~0,5 N/m und einem Radius von ~9 µm untersucht. Alle Messungen wurden im Eindringungskontrollmodus (d. h. in einem geschlossenen Regelkreis, sodass die Eindringungsrate während der gesamten Ladephase konstant ist) mit einer Eindringungsrate von 5 µm/s und einer Zieleindrückung von 5 µm durchgeführt; Im Fall von AFM wurde diese Wahl ebenfalls getroffen, um sowohl der parabolischen Indenter-Näherung der Hertzschen Theorie zu entsprechen als auch den Bodeneffekt zu vermeiden, der durch die endliche Dicke der Probe entsteht65,66.

Um die optimale Eindringtiefe zu ermitteln, wurden in verschiedenen Eindringbereichen erhaltene YMs verglichen und die Oberflächenrauheit mittels optischer Profilometrie (Veeco WYKO NT9100 und OCT, (ergänzende Abbildung 4)) analysiert. Die letztgenannten Techniken zeigten eine skalenabhängige Rauheit , mit arithmetischen Rauheitswerten von etwa 2–300 nm, wenn Bereiche mit Radien von ~10 µm analysiert wurden (d. h. der Maßstab des Kontakts der Eindringkörperkugel). Um einen konformen Gewebe-/Eindringkörperkontakt sicherzustellen, führten wir nach dem Ausschluss eine Hertzsche Anpassung durch erster Abschnitt des Kontakts. Wir betrachteten eine Anpassung als gültig, wenn R2 > = 0,90 war. Wir verglichen auch die Anpassungsergebnisse für verschiedene Eindrucktiefenbereiche (1–3 µm, 3–5 µm): Wir beobachteten, dass bei verschiedenen Eindrucktiefen die YM blieb weitgehend gleich, mit einem leichten Anstieg der Anzahl abgelehnter Anpassungen mit zunehmender Eindringtiefe (ergänzende Abbildung 5), was auf ein leichtes nichtlineares Verhalten bei größeren Dehnungen hindeutet. Wir haben uns entschieden, die Analyse auf flache Eindrückungen zu beschränken ( 0,2–1,2 µm), um konsistentere Ergebnisse zu erhalten und die Ergebnisse einfacher mit dem AFM-Datensatz zu vergleichen; Diese Wahl stellte auch sicher, dass der maximale Eindruck deutlich größer war als der typische Rauheitswert.

Es wurden 10 µm dicke Kryoschnitte der Blase angefertigt, das OCT mit PBS abgewaschen und die Gewebeschnitte auf 4 % PFA fixiert. Dann wurde die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung wie folgt durchgeführt; Die Objektträger wurden zweimal mit MilliQ-Wasser gewaschen und die Zellkerne wurden 50 Sekunden lang mit Hämatoxylin angefärbt, anschließend 5 Minuten lang in MilliQ-Wasser gewaschen und 15 Sekunden lang auf Eosin inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Gewebeträger auf einem ansteigenden Ethanolgradienten dehydriert und dann auf Xylol als Klärmittel inkubiert. Anschließend wurden die Proben mit Eukit montiert. Eine umfassende histopathologische Analyse der HE-Objektträger wurde von unserem erfahrenen Uro-Pathologen (RL) blind im Hinblick auf die mechanischen Daten durchgeführt. Darüber hinaus wurden dieselben Gewebeschnitte, die zuvor für mechanische Messungen verwendet wurden (50 µm dick), fixiert und HE-gefärbt, um die Gewebeschichten zu bestätigen (20 Sekunden Hämatoxylin und 15 Sekunden Eosin).

Die Kollagenquantifizierung aus HE-gefärbten Geweben erfolgte durch Quantifizierung der Kollagendoppelbrechung anhand von Bildern, die mit polarisiertem Licht im Dunkelfeldmikroskop (Zeiss AxioImager M2M) aufgenommen wurden. Alle Bilder wurden mit einem 10X-Objektiv (APOCHROMAT 10X – NA 0,4 5) aufgenommen und mit der ImageJ-Software analysiert. Die Bilder wurden zunächst in 8-Bit-Bilder umgewandelt, der Schwellenwert wurde manuell angepasst, um Hintergrundrauschen zu entfernen und alle positiven Pixel aus dem Gewebe zu sammeln. Der Prozentsatz des Flächenanteils über dem festgelegten Schwellenwert wurde quantifiziert.

Der mittlere YM-Wert pro Gewebeschicht und Ratte wurde berechnet. Da sowohl AFM- als auch Nanoindenter-Instrumente vergleichbare YM-Werte liefern und die Kraftkurven konzeptionell auf die gleiche Weise gemessen werden, stellen die hier gemeldeten Ergebnisse doppelte Daten dar, die sowohl von AFM als auch von Nanoindenter erfasst wurden, und gezogene Medianwerte, die von beiden Instrumenten pro Ratte und Gewebeschicht erhalten wurden .

Um die Wirkung der Röntgenbestrahlung und der BBN-Behandlung in jeder Gewebeschicht zu analysieren, haben wir die mittleren YM-Faltungsänderungen in Bezug auf die gesunden Ratten berechnet. Dazu haben wir zunächst den AFM- und Nanoindenter-Median-YM-Wert jeder Ratte für jede Gewebeschicht zu einem bestimmten Zeitpunkt gemittelt. Dies ergibt 3 mittlere Werte (einen pro Ratte) bei jeder der untersuchten Bedingungen. Da wir an den (mechanischen) Veränderungen als Folge eines Krankheitszustands interessiert waren, haben wir behandelte Tiere mit Kontrolltieren gepaart. Da es sich bei jeder gemessenen Ratte um einen Endpunkt handelte, gingen wir davon aus, dass jede Erkrankung von einer der gesunden Ratten herrühren konnte. Dies bedeutet, dass die möglichen Fold-Changes pro Bedingung die Kombinationen von 3 Kontroll- und 3 behandelten Ratten pro Zeitpunkt sind;

(C = Kontrolle, T = behandelt)

Rat1T/Ratte1C, Rat2T/Ratte1C, Rat3T/Ratte1C,

Rat1T/Rat2C, Rat2T/Rat2C, Rat3T/Rat2C,

Rat1T/Rat3C, Rat3T/Rat3C, Rat3T/Rat3C.

Dies ergibt 9 Nummern pro Behandlung und Zeitpunkt. Wenn wir jeweils 1 (keine fache Änderung gegenüber Kontrollratten) subtrahieren, können wir die resultierende Verteilung mit einem 2-Wege-t-Test testen, um die Hypothese zu überprüfen, dass sie einen Mittelwert ungleich Null hat.

Um die Kinetik der Behandlung mit 2-Wege-Anova und Tukey zu untersuchen, wurde ein mehrfacher Vergleichstest durchgeführt, bei dem der Mittelwert der mittleren YM-Werte jeder Gewebeschicht jeder einzelnen Ratte zu verschiedenen Zeitpunkten verglichen wurde. Wir überprüften die Normalität der YM-Verteilungen, indem wir für beide Instrumente Quantil-Quantil-Diagramme (QQ) pro Ratte und Gewebeschicht erstellten. Für die YM-Verteilungen, die nicht normalverteilt waren, wurde ein nichtparametrischer statistischer Test durchgeführt (Mann-Whitney-Test).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Quelldaten hinter Grafiken und Diagrammen finden Sie unter https://figshare.com/projects/Micro-mechanical_fingerprints_of_the_rat_bladder_change_in_actinic_cystitis_and_tumor_presence/158222. Die Quelldaten sind in den Zusatzdaten 1–9 enthalten. Weitere Informationen können auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor eingeholt werden.

Der Code ist auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken H. Holuigue und E. Lorenc für die Unterstützung bei AFM-Messungen. Diese Forschung wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm „Horizont 2020“ der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Maßnahme-Zuschussvereinbarung Nr. 812772 (Projekt Phys2Biomed) finanziert und erhielt Mittel durch das Forschungs- und Innovationsprogramm „Horizont 2020“ der Europäischen Union unter der Zuschussvereinbarung 801126 (EDIT). ).

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R. Luciano

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Korrespondenz mit A. Podestà oder M. Alfano.

MB und KB sind bei Optics11 BV beschäftigt. Alle anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Alexander Cartagena-Rivera und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Martinez-Vidal, L., Chighizola, M., Berardi, M. et al. Mikromechanische Fingerabdrücke der Rattenblase verändern sich bei aktinischer Zystitis und Tumorpräsenz. Commun Biol 6, 217 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04572-0

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Eingegangen: 19. August 2022

Angenommen: 09. Februar 2023

Veröffentlicht: 24. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04572-0

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